三氧化二砷免疫毫微球靶向治療膀胱腫瘤的研究.pdf

1、【目的】制備單抗BDI-1導(dǎo)向的三氧化二砷免疫蛋白微球[As2O3-(BSA-NS)-BDI-1]并驗(yàn)證其對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞的特異性結(jié)合和殺傷作用，以最大程度減輕As2O3毒副作用，實(shí)現(xiàn)其導(dǎo)向化療。 【方法】1、通過(guò)交聯(lián)固化的方法制備三氧化二砷白蛋白微球(As2O3-BSA-NS)，按正交設(shè)計(jì)優(yōu)化制備工藝。電鏡觀察、原子熒光分析的方法評(píng)價(jià)微球質(zhì)量，體外釋藥方法研究其釋藥特性。2、采用雜交瘤細(xì)胞BDI-1腹腔種植的方法制備單克隆抗體B

2、DI-1并采用親和層析的方法純化抗體。免疫熒光的方法鑒定抗體活性并測(cè)量其效價(jià)。通過(guò)N-羥基琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)-丙酸脂(SPDP)交聯(lián)的方法制備蛋白免疫微球，還原電泳、光鏡和電鏡的方法鑒定As2O3免疫微球的共價(jià)連接與活性，吖啶橙染色檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡。3、3氫-胸腺嘧啶核苷(3H-TDR)摻入法檢測(cè)As2O3-(BSA-NS)-BDI-1的細(xì)胞殺傷活性，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞凋亡。4、通過(guò)BIU-87細(xì)胞種植的方法建立裸

3、鼠膀胱腫瘤的原位模型，經(jīng)尿道置套管針膀胱灌注給藥。觀察小鼠一般情況并記錄生存時(shí)間，解剖顯微鏡和膀胱腫瘤石蠟切片染色觀察膀胱腫瘤生長(zhǎng)和浸潤(rùn)情況及各器官毒性反應(yīng)。原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況。 【結(jié)果】1、確定As2O3-BSA-NS制備工藝的最佳組合為A4B3C2D4，其DF值為0.76534。電鏡觀察進(jìn)一步證實(shí)制備的As2O3-NS形狀規(guī)則、大小合適，體外釋藥實(shí)驗(yàn)證實(shí)As2O3蛋白微球釋藥速度明顯慢于

4、單純的As2O3。2、所制備抗體純度較高，其效價(jià)達(dá)1：20，000，紫外分光光度計(jì)分析抗體濃度達(dá)5mg/ml，SDS-PAGE還原電泳可見(jiàn)免疫微球被還原后在遠(yuǎn)端形成兩條蛋白條帶。光鏡下可見(jiàn)蛋白免疫微球在腫瘤細(xì)胞周?chē)㈦S細(xì)胞移動(dòng)。電鏡下可見(jiàn)蛋白微球與腫瘤細(xì)胞緊密連接且形態(tài)完整。吖啶橙染色可見(jiàn)免疫微球處理的膀胱腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出凋亡特征。3、As2O3-(BSA-NS)-BDI-1殺傷膀胱腫瘤細(xì)胞的效果明顯好于As2O3-BSA-NS和As2O

5、3(P＜0.05)。AnnexinV-PI染色流式細(xì)胞分析顯示膀胱腫瘤細(xì)胞被誘導(dǎo)凋亡，免疫蛋白微球的誘導(dǎo)效果明顯好于蛋白微球和As2O3(P＜0.05)。4、成功建立小鼠膀胱腫瘤原位模型，顯微鏡及石蠟切片觀察到膀胱灌注As2O3-(BSA-NS)-BDI-1組腫瘤生長(zhǎng)及向周?chē)?rùn)受到明顯抑制(95.2％)，且各器官毒性反應(yīng)明顯較灌注As2O3輕。As2O3-(BSA-NS)-BDI-1組小鼠膀胱腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯高于其他組(P＜0.05