MMP9-PEX的原核表達(dá)及對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響.pdf

1、PEX存在于大多數(shù)MMPs羧基末端，是多種物質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)，它的突變對(duì)1VI]VIPs功能有著重要的影響。并且它可通過]V[MPs的自身作用被降解，產(chǎn)生一分子質(zhì)量為29kDa32kDa的PEX片段。在各種人類膠質(zhì)瘤、內(nèi)皮、乳房和前列腺的癌細(xì)胞系的培養(yǎng)基中都可以檢測(cè)到PEX片段。PEX片段是IV[]VIPs的內(nèi)源性活化抑制劑，在不同病理生理?xiàng)l件下可以抑制血管生成。 在腫瘤的轉(zhuǎn)移和胚胎植入的過程中，1V[~／[Ps起到了很大的作用尤其

2、是MMP2和MMP9，它們通過降解ECM來促進(jìn)腫瘤和滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲。作為～MMPs的內(nèi)源性活化抑制劑，PEX在這些過程中可能也會(huì)起著重要的作用，但其在胚胎植入中的功能卻知之甚少。 目的：本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建pET32a／PEX原核表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)并提純重組蛋白，為進(jìn)一步研究PEX基因的功能和蛋白的作用奠定基礎(chǔ)。并采用Transwll實(shí)驗(yàn)，分析重組蛋白pET32a／PEX對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲的影響及其對(duì)侵襲影響的劑量關(guān)系，探討其作用機(jī)理，為

3、將來探尋PEX在胚胎發(fā)育、胚胎植入和腫瘤侵襲中的作用奠定良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：1．RT-PCR法擴(kuò)增MMP9-PEX基因，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后克隆入原核表達(dá)載體pET32a中，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行酶切和DNA雙向測(cè)序鑒定。2．將重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)，用SDS-PAGE鑒定，用尿素裂解緩沖液溶解包含體并采用親和層析有效分離出目標(biāo)蛋白。3．采用Transwll實(shí)驗(yàn)觀察重組蛋白pET32a／PEX對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲過程的影響及對(duì)

4、侵襲影響的劑量關(guān)系。 結(jié)果：1．RT-PCR擴(kuò)增片段大小與預(yù)期的MMP9-PEX片段大小(594bp)相同，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET32a／PEX經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，DNA雙向測(cè)序證實(shí)與其序列一致。2．重組質(zhì)粒在大腸桿菌中高效表達(dá)，產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE方法鑒定為42KD的pET32a／PEX融合蛋白，目的蛋白含量占菌體總蛋白含量的50％左右，經(jīng)純化后得到純度為90％以上的融合蛋白。3．結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲的抑制呈劑量依賴性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)融

5、合蛋白pET32a／PEX重組蛋白的濃度為100ug／ml時(shí)，對(duì)細(xì)胞侵襲能力的抑制達(dá)到最高峰，約93％的細(xì)胞侵襲能力受到抑制；而當(dāng)濃度升高到500ug／ml時(shí)抑制率有所下降，為76％。 結(jié)論：1．利用pET32a表達(dá)載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET32a／PEX，能高效表達(dá)重組蛋白pET32a／PEX。而且運(yùn)用親和層析技術(shù)能使目標(biāo)蛋白得到有效的分離。2．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組蛋白pET32a／PEX能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲，說明利用原核系統(tǒng)可得