綠茶多酚對高脂誘導的代謝紊亂和血管內(nèi)皮功能障礙的影響.pdf

1、第一部分：綠茶多酚對高脂誘導代謝紊亂的影響
　　目的:觀察高脂膳食對大鼠代謝指標的影響和肝臟脂肪沉積以及肝臟糖脂代謝相關(guān)基因表達的影響,并觀察綠茶多酚對高脂膳食誘導的代謝改變、肝臟脂肪沉積和糖脂代謝基因表達改變的干預效果。
　　方法:體重40-60g斷乳雄性Wistar大鼠50只,適應性喂養(yǎng)一周后,分為5組,對照組給予標準飼料,高脂組和三個綠茶多酚干預組給予高脂飼料,實驗開始時所有大鼠飲用去離子水,綠茶多酚干預組在達到成年體

2、重后改為飲用不同濃度的綠茶多酚水溶液,第26周進行口服糖耐量試驗(OGTT),26周末,處死大鼠,分離血清。用ELISA檢測血清中胰島素的含量;用生化試劑盒檢測血糖、血脂水平,計算HOMA-IR指數(shù);精確稱量肝臟、睪周脂肪和腎周脂肪的重量,計算內(nèi)臟脂肪系數(shù)和肝臟系數(shù);取部分肝臟組織冰凍切片,進行油紅O染色。采用實時熒光定量PCR方法檢測肝臟組織中脂肪合成酶(FAS)、羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCoAR)、過氧化物酶體增殖物激活

3、受體α(PPARα)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)、葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2(GLUT2)的mRNA表達水平。
　　結(jié)果:對照組大鼠進食量顯著高于其它組,但是各組大鼠能量攝入量沒有顯著差異。自第9周開始,高脂組大鼠體重顯著高于對照組,這種差異持續(xù)到實驗結(jié)束。實驗結(jié)束時,高脂組大鼠體重和內(nèi)臟脂肪系數(shù)都顯著高于對照組,與高脂組相比,綠茶多酚干預組大鼠的體重

4、和內(nèi)臟脂肪系數(shù)都顯著降低。與對照組相比,高脂組大鼠空腹血糖水平、空腹胰島素水平,胰島素抵抗指數(shù)和OGTT試驗曲線下面積都顯著升高,綠茶多酚干預降低了高脂飼養(yǎng)大鼠的血糖水平,胰島素抵抗指數(shù)和OGTT試驗曲線下面積,但是對胰島素水平?jīng)]有明顯影響。高脂飼養(yǎng)導致了大鼠血脂紊亂,其中血清甘油三酯(TG),低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和總膽固醇(TC)水平與對照組相比顯著升高,高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平顯著下降,LDL-C/HDL-C

5、值顯著上升,綠茶多酚干預降低了高脂飼養(yǎng)大鼠血清TG、TC、LDL-C、LDL-C/HDL-C的水平,但是對HDL-C的水平?jīng)]有明顯影響。高脂飼養(yǎng)引起了大鼠肝臟脂肪沉積,肝臟系數(shù)升高,并引起了肝臟中糖脂代謝相關(guān)基因的表達改變,其中脂肪合成相關(guān)的基因FAS、HMG-CoAR和SREBP-1和糖異生關(guān)鍵限速酶PEPCK和G6Pase的mRNA表達水平顯著升高,脂肪酸氧化相關(guān)的基因PPARα和肝臟中主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運體GLUT2的mRNA表達水平

6、顯著降低。綠茶多酚干預降低了高脂飼養(yǎng)大鼠的肝臟系數(shù)和肝臟脂肪沉積,并抑制了高脂誘導的大鼠肝臟糖脂代謝基因表達改變。
　　結(jié)論:高脂飼養(yǎng)誘導大鼠發(fā)生代謝紊亂,肝臟脂肪沉積和糖脂代謝相關(guān)基因的表達異常,這些改變與能量攝入無關(guān);綠茶多酚干預能夠預防和改善高脂誘導的代謝紊亂和肝臟脂肪沉積。
　　第二部分：綠茶多酚對脂聯(lián)素水平的影響及細胞信號機制
　　目的:綠茶多酚的代謝調(diào)節(jié)機制到目前為止尚不清楚。脂聯(lián)素被認為是肥胖和胰島素抵抗

7、治療的新靶點。本部分主要觀察綠茶多酚對高脂飼養(yǎng)大鼠脂聯(lián)素水平的影響并探索相關(guān)機制。
　　方法:動物飼養(yǎng)與干預同第一部分,血清脂聯(lián)素水平采用ELISA方法檢測,用實時熒光定量PCR檢測大鼠內(nèi)臟脂肪組織中脂聯(lián)素和PPARγ的mRNA表達水平,采用免疫印跡法檢測PPARγ,磷酸化PPARγ,細胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK1/2和磷酸化ERK1/2的蛋白表達水平。采用高糖DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)大鼠內(nèi)臟脂肪組織,并進行綠茶多酚進行干預和ERK1/

8、2的特異性抑制劑PD98059進行預處理。干預24h后,收集培養(yǎng)液,檢測其中的脂聯(lián)素水平,收集培養(yǎng)的內(nèi)臟脂肪組織檢測脂聯(lián)素和PPARγ的mRNA表達水平以及PPARγ,磷酸化PPARγ,ERK1/2和磷酸化ERK1/2的蛋白表達水平。
　　結(jié)果:高脂組大鼠脂聯(lián)素mRNA水平和血清脂聯(lián)素水平都顯著低于對照組,而綠茶多酚干預顯著升高了脂聯(lián)素水平。與對照組相比,高脂組大鼠內(nèi)臟脂肪中ERK1/2的激活和PPARγ的磷酸化顯著升高,而PPA

9、Rγ的mRNA水平和蛋白表達水平顯著降低,與高脂組相比,綠茶多酚干預組ERK1/2和PPARγ磷酸化水平顯著降低,而PPARγ表達水平顯著升高。采用高糖體外培養(yǎng)內(nèi)臟脂肪組織也顯著降低了內(nèi)臟脂肪組織中脂聯(lián)素mRNA水平,分泌到培養(yǎng)液中的脂聯(lián)素水平和PPARγ的表達水平,而上調(diào)了ERK1/2和PPARγ的磷酸化水平。而綠茶多酚干預和ERK1/2抑制劑處理均能抑制高糖培養(yǎng)誘導的這些改變。
　　結(jié)論:上調(diào)脂聯(lián)素水平是綠茶多酚抑制高脂飲食誘

10、導代謝紊亂的重要機制之一。綠茶多酚通過抑制ERK1/2的激活,降低PPARγ的磷酸化水平和上調(diào)PPARγ表達水平來上調(diào)脂聯(lián)素的水平。
　　第三部分：綠茶多酚對血管內(nèi)皮高通透性的影響及機制
　　目的:觀察高脂飼料飼養(yǎng)大鼠主動脈內(nèi)皮通透性的改變和綠茶多酚的干預效果,并在體內(nèi)、體外細胞實驗中探索綠茶多酚調(diào)控通透性改變的機制。
　　方法:動物飼養(yǎng)與干預同第一部分,牛主動脈內(nèi)皮細胞(BAECs)采用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),分別采用綠茶多

11、酚,二苯基碘(DPI)、SU5416(VEGF受體2抑制劑)、rhVEGF和β環(huán)糊精(胞膜窖結(jié)構(gòu)抑制劑)進行干預后,檢測單層BAECs通透性。大鼠主動脈內(nèi)皮通透性采用伊文思藍注射法測定,單層BAECs通透性利用穿過細胞的異硫氰酸熒光素(FITC)-右旋糖酐測定。采用二氫乙啶(DHE)熒光探針檢測大鼠主動脈活性氧(ROS)水平,采用2',7'-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)熒光探針檢測細胞中的ROS水平。采用實時定量PCR方法檢測V

12、EGF和窖蛋白1的mRNA表達水平,采用ELISA檢測大鼠血清和細胞培養(yǎng)液中的VEGF水平,采用蛋白免疫印跡法檢測培養(yǎng)的BAECs中的cav-1蛋白表達水平。
　　結(jié)果:與對照組相比,高脂組大鼠主動脈通透性顯著升高,與高脂組相比,綠茶多酚干預組主動脈通透性顯著降低。高脂膳食顯著上調(diào)了大鼠的血清VEGF水平、主動脈中VEGF的mRNA表達水平和主動脈中的ROS水平,而綠茶多酚干預顯著抑制了高脂誘導VEGF和ROS水平的升高。采用高糖

13、培養(yǎng)基體外培養(yǎng)BAECs,顯著上調(diào)了單層BAECs的通透性、VEGF的表達和分泌水平、以及細胞內(nèi)ROS水平,同時還上調(diào)了NADPH氧化酶亞基p22phox和p67phox亞基的表達水平,并誘導了窖蛋白1表達水平升高,而綠茶多酚顯著改善了高糖誘導的BAECs通透性、VEGF的表達和分泌水平、ROS、NADPH氧化酶亞基和窖蛋白1表達水平的升高。與高糖培養(yǎng)類似,rhVEGF預處理顯著升高了普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的單層BAECs的的通透性,而VEGF

14、受體抑制劑SU5416預處理、NADPH氧化酶抑制劑DPI預處理和檢測前采用胞膜窖結(jié)構(gòu)抑制劑β環(huán)糊精孵育都顯著降低了高糖培養(yǎng)單層BAECs的通透性,SU5416預處理還顯著降低了窖蛋白1的表達水平。
　　結(jié)論:高脂膳食能夠誘導大鼠主動脈內(nèi)皮通透性升高,這種效應能夠被綠茶多酚有效改善。綠茶多酚調(diào)節(jié)高脂飼養(yǎng)大鼠內(nèi)皮通透性的可能信號途徑為:下調(diào)NADPH氧化酶表達水平,降低ROS產(chǎn)生,進而下調(diào)VEGF水平,降低窖蛋白1的表達水平,減少胞