改性后的rhBMP-2聚乳酸緩釋納米微球的制備及促進下頜骨缺損修復的實驗研究.pdf

1、先天性畸形、腫瘤、以及外傷等因素造成的頜骨缺損修復一直是困擾口腔頜面外科醫(yī)生的一個難題。頜骨缺損一方面造成患者咀嚼、發(fā)音等功能障礙,另一方面造成美觀問題,加重患者的心理負擔。隨著社會的發(fā)展和進步,交通事故的發(fā)生機率也越來越大,頜骨缺損的發(fā)生率日益增高。因此,探索更好的骨缺損修復方法是臨床研究的熱點之一。頜骨的缺損修復與全身其他部位骨缺損修復相比具有獨特性:固定和復位的要求更加嚴格;在復位固定后,進食的限制也往往影響到骨缺損的愈合;必須在

2、恢復咀嚼、發(fā)音等功能的基礎上,同樣滿足患者對整體外觀的要求。因此,臨床上頜骨缺損修復必須要求嚴格的復位和固定,并力求骨缺損盡可能快的進行修復。
　　組織工程化骨構建是未來解決有成骨活性的頜骨缺損修復的方向。已有研究在缺損區(qū)內植入含有誘導成骨能力的人重組骨形成蛋白-2(recombinantHumanbonemorphogeneticprotein-2,rhBMP-2)的可降解支架,沒有很好解決rhBMP-2體內半衰期短,穩(wěn)定性差,

3、生物利用度低等缺點和支架材料親和性和降解性問題。rhBMP-2為早期骨缺損修復啟動因子,可促進軟骨和骨形成,其表達方式為誘導和促進通過細胞核內相關基因的表達,從而誘導細胞分化。
　　納米技術是一門在納米級下對物質進行制備,并與多個學科相互交叉發(fā)展的綜合性科技體系和交叉學科。納米微球被器官或者組織吸收,可以延長藥效,提高利用度,可通過對包裹材料的調控從而實現(xiàn)體內的納米微球緩釋并靶向分布。
　　基于以上分析,結合國內外研究進展,

4、本課題采用改性后聚乳酸(polylacticacid,PLA)為包裹材料,制備rhBMP-2-mPEG-PLA納米微球(rhBMP-2-mPEG-PLA-Ns)及mPEG-PLA-Ns納米微球,探討rhBMP-2緩釋系統(tǒng)加速頜骨缺損修復的方法。
　　rhBMP-2-mPEG-PLA納米微球及mPEG-PLA-Ns膠體液分別制成凝膠,研究微球藥物形態(tài)和粒徑分布;載藥量和包封率;體外緩釋時間等。建立兔下頜骨缺損模型,分別通過HE染色,

5、免疫組化檢測增殖細胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA),觀察不同周期下rhBMP-2-mPEG-PLA納米微球和mPEG-PLA-Ns凝膠對頜骨缺損修復的療效。
　　實驗方法和結果
　　1、mPEG-PLA-Ns和rhBMP-2-mPEG-PLA納米微球的制備和其物理、化學特性:
　　mPEG-PLA納米微球制備:Malvern激光粒度分布測試儀測定三組mPEG-PLA膠

6、體平均粒徑分別為160nm,158nm,169nm,達到實驗要求。對rhBMP-2進行精密度、二氯甲烷和丙酮混合物中穩(wěn)定性測定,證實rhBMP-2精密度和穩(wěn)定性可靠。采用復乳-干燥法(w/o/w)將rhBMP-2和mPEG-PLA制備成mPEG-PLA-Ns和rhBMP-2mPEG-PLA納米微球,通過透視電鏡和Malvern激光粒度分布測試儀測定,顯示微球的粒徑為45~50nm,該納米微球表面光滑圓整,球體大小均勻,粒徑分布范圍窄。通

7、過處方優(yōu)化采用1％乳糖作為支架劑,載藥量和包封率研究顯示rhBMP-2-mPEG-PLA納米微球包封率和載藥量分別為(78.2±1.81)%和[(2.24±0.24)×10-5]%,模擬體內環(huán)境研究表明,rhBMP-2-mPEG-PLA納米微球在14d內,所釋放出的rhBMP-2的濃度能夠保持在一定的水平,并且能夠持續(xù)釋放rhBMP-2。rhBMP-2-mPEG-PLA納米微球濃度平均為(74.53±5.16)ng/ml。以累積釋放率和

8、時間一起進行擬合,根據Higuichi方程,rhBMP-2-mPEG-PLA納米微球的體外釋放藥物率,Q=26.7687t1/2-12.3283,r=0.9962。體外釋放試驗中,沒有發(fā)現(xiàn)突釋現(xiàn)象,24小時釋放率為23.47%,微球在21天后釋放度達78.56%。
　　2、mPEG-PLA-Ns和rhBMP-2-mPEG-PLA納米微球促進下頜骨缺損修復的動物實驗:
　　建立兔下頜骨缺損模型,隨機分為3組,建立動物模型:空白

9、組,單純性mPEG-PLA納米微球緩釋凝膠組(對照組),rhBMP-2-mPEG-PLA納米微球緩釋凝膠組(實驗組),在缺損區(qū)分別植入單純性mPEG-PLA納米緩釋凝膠和改性后的rhBMP-2-mPEG-PLA納米微球緩釋凝膠,分別在術后1周,2周,4周處死動物。
　　對骨缺損斷端病理切片行HE染色觀察。結果提示:與空白組和對照組相比,試驗組術后1周有新生骨小梁形成;術后2周有較多編織骨形成,成熟度高;術后4周編織骨進一步增多、成

10、熟、融合,可見大量新生血管和繼發(fā)性骨痂形成,骨痂比例明顯高于空白組和對照組。
　　骨缺損斷端影像學顯示第1、2周,空白組可見缺損區(qū)域明顯,對照組及實驗組缺損區(qū)相對空白組愈合較好,經過4周后,空白組骨缺損區(qū)陰影仍然較大,未見明顯新生骨形成;對照組骨缺損區(qū)陰影縮小,缺損區(qū)周圍有新骨形成;實驗組骨缺損區(qū)修復良好,骨缺損區(qū)陰影已不明顯。
　　骨缺損斷端病理切片PCNA免疫組化研究結果證實,與空白組相比,實驗組和對照組在1、2周PCN