耐糖皮質(zhì)激素人淋巴瘤細(xì)胞系Toledo-DEX的建立及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、目的：建立人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)耐糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GC)細(xì)胞系Toledo/DEX，并對其生物學(xué)特性及耐藥機制進行初步研究。
　　方法：以地塞米松(dexamethasone，DEX)為誘導(dǎo)劑，用長期間歇小劑量GC遞增法誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞系。將對數(shù)期Toledo細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，置于含DEX起始濃度為1×10-8M的培養(yǎng)液中培養(yǎng)96小時后

2、，改為不含藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞增殖再次進入對數(shù)生長期，提高DEX濃度1倍，直至在含DEX1.024×10-5M的濃度中穩(wěn)定生長。用CCK-8法檢測不同暴露時間及不同濃度的DEX對耐藥細(xì)胞及親本細(xì)胞增殖抑制作用的差異，同時檢測耐藥細(xì)胞及親本細(xì)胞對DEX的藥物敏感性，計算耐藥指數(shù)。將耐藥細(xì)胞脫離DEX作用后檢測其耐藥穩(wěn)定性。
　　觀察耐藥細(xì)胞系和親本細(xì)胞系的生物學(xué)特性。通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞一般形態(tài)學(xué)變化，透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超

3、微結(jié)構(gòu)變化；CCK-8法測定倍增時間及耐藥指數(shù)，繪制生長曲線；利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞免疫表型；采用常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)方法，R顯帶后進行核型分析；利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期比例，了解細(xì)胞周期分布。觀察兩種細(xì)胞在裸鼠成瘤性的差異。westernblot方法檢測GRα/β蛋白表達的變化。
　　結(jié)果：歷經(jīng)6月的培養(yǎng)，建立了耐藥細(xì)胞系Toledo/DEX，并對耐藥細(xì)胞進行生物學(xué)特性觀察。形態(tài)上，耐藥細(xì)胞與親本細(xì)胞相似，懸浮生長，細(xì)胞大小不均一，

4、呈圓形或橢圓形，體積較正常的淋巴細(xì)胞大，胞漿少，細(xì)胞核大，占據(jù)大部分細(xì)胞體積，且大小不一。經(jīng)瑞氏染色在光學(xué)顯微鏡下觀察，可見兩種細(xì)胞形態(tài)無明顯差異，油鏡下形態(tài)與Burkitt淋巴瘤細(xì)胞形態(tài)相似，細(xì)胞胞體偏大，形態(tài)不規(guī)則，核/漿比例增高，胞漿淡藍色，漿內(nèi)見空泡。核不規(guī)則，可見多個核仁及核裂。透射電鏡觀察，耐藥細(xì)胞Toledo/DEX超微結(jié)構(gòu)與Toledo大體一致，不同點是其局部可見片層狀突起，有細(xì)長微絨毛。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞免疫表型示兩種

5、細(xì)胞完全一致，均為CD2-、CD3-、CD5-、CD7-、CD10+、CD19+、CD79α+、CD20+、CD38+、CD16-、CD56-、CD22-。R顯帶行染色體核型分析示耐藥細(xì)胞除親本細(xì)胞的染色體變異外，還存在1、4、7、10號染色體異常，但均未形成兩個相關(guān)的克隆。細(xì)胞生長曲線示耐藥細(xì)胞細(xì)胞增殖速度比親本細(xì)胞緩慢。PI檢測細(xì)胞周期分布發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞G1期細(xì)胞增多，而S期和G2期細(xì)胞減少。兩種細(xì)胞裸鼠成瘤率為0％。耐藥譜分析示耐藥

6、細(xì)胞相對于親本細(xì)胞，對地塞米松、阿霉素(adriamycin，ADM)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)和長春新堿(vincristine，VCR)的耐藥指數(shù)分別為1227倍、2.05倍、2.63倍和1.86倍，其中對DEX和CTX耐藥性的提高具有統(tǒng)計學(xué)意義。Western Blot檢測GRα、GRβ蛋白的表達，結(jié)果示GRα、GRβ蛋白在Toledo和Toledo/DEX細(xì)胞均表達。耐藥細(xì)胞GRα表達下調(diào)，且隨著耐藥