白芍水提取物對(duì)PDE-7A活性影響檢測(cè)及其對(duì)泡沫細(xì)胞膽固醇流出影響研究.pdf

1、[目的]
　　 膽固醇在巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)聚積是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)形成的重要事件之一，從肝外組織清除過量膽固醇是預(yù)防和治療AS的關(guān)鍵步驟。研究證實(shí)，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ABCA1)在促進(jìn)膽固醇流出過程中具有重要作用。同時(shí)，環(huán)腺苷一磷酸（cAMP）可上調(diào)ABCA1表達(dá)。磷酸二酯酶7(phosphodiesterase7，PDE7)通過水解作用降低細(xì)胞組織中的cAMP濃度。而實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在膽固醇累積及細(xì)胞泡沫化過程中PDE

2、7基因表達(dá)升高。抑制PDE-7基因表達(dá)或蛋白水解酶活性可增強(qiáng)ABCA1表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞過量膽固醇流出。為此，本實(shí)驗(yàn)以PDE-7A作為研究靶點(diǎn)，體外測(cè)定白芍水提取物(Radix Paeoniae Albaextraction，RPAE)對(duì)PDE-7A活性的影響，并在巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞上測(cè)定其對(duì)膽固醇流出的影響及可能機(jī)制。
　　 [方法]
　　 1.100g粉碎的中藥白芍溫水(55℃)室溫浸泡1h，回流提取2h，過濾。濾

3、渣再回流提取1次，合并2次濾液，減壓抽濾。所得濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至藥材質(zhì)量1倍，加入等體積95％乙醇，4℃靜置48 h，過濾、離心，取上清再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至100ml。
　　 2.采用PDE-Glo Phosphodiesterase Assay Kit，體外測(cè)定RPAE對(duì)PDE-7A活性的影響，并以IBMX、BRL-50481作為對(duì)照。
　　 3.CCK-8法檢測(cè)RPAE細(xì)胞毒性。人THP-1細(xì)胞用160nM佛波酯(ph

4、orbol12-myristate13-acetate，PMA)37℃、5％CO2誘導(dǎo)24 h，分化為貼壁巨噬細(xì)胞。不同濃度RPAE作用于巨噬細(xì)胞24 h后，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，并計(jì)算藥物半數(shù)致死濃度值(lethal dose50％，LD50)。
　　 4.THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型的建立及鑒定。160 nM PMA誘導(dǎo)人THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞后，用50μg/ml乙?；兔芏戎鞍?acetylated l

5、ow density lipoprotein，ac-LDL)孵育48 h，誘導(dǎo)為泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞經(jīng)多聚甲醛固定、油紅O染色、蘇木精復(fù)染后，于相差顯微鏡下觀察，鑒定泡沫細(xì)胞模型。進(jìn)一步采用HPLC分析泡沫細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇及膽固醇酯的累積。
　　 5.液體閃爍計(jì)數(shù)法檢測(cè)膽固醇流出率。人THP-1細(xì)胞經(jīng)160 nM PMA誘導(dǎo)后，與3H標(biāo)記膽固醇及ac-LDL共同孵育48 h后，用不同濃度RPAE(10、1.0、0.1 mg生藥/m

6、l水提取物)及10μg/ml載脂蛋白A-1（apolipoproteinA-1，apoA-1）作用24 h，分別收集培養(yǎng)基上清液和細(xì)胞，檢測(cè)各組分的放射劑量，并計(jì)算膽固醇流出率。
　　 6.不同濃度RPAE作用泡沫細(xì)胞后，試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PDE-7A活性及cAMP相對(duì)含量變化。
　　 7.不同濃度RPAE作用泡沫細(xì)胞后，Western blot檢測(cè)PDE-7A、ABCA1蛋白表達(dá)變化，并通過相對(duì)光密度分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

7、
　　 [結(jié)果]
　　 1.100g白芍通過水法提取，95％乙醇沉淀等處理得到100 ml水提取物溶液，即1g生藥/ml白芍水提取液（RPAE）。0.22μm微孔濾膜過濾，4℃冷藏保存。
　　 2.RPAE對(duì)PDE-7A蛋白酶活性檢測(cè)結(jié)果表明，10 mg生藥/ml RPAE對(duì)PDE-7A活性具有明顯抑制作用，抑制率達(dá)到86％。抑制劑IBMX與BRL-50481在222.24μg/ml、244.27μg/ml時(shí)對(duì)P

8、DE-7A活性抑制率達(dá)到78％和88％。
　　 3.CCK-8法測(cè)定表明，RPAE對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞具有一定毒性，10、1.0、0.1 mg/ml RPAE處理組，細(xì)胞存活率分別為85.36％、95.53％和100％;LD50值為60.45 mg生藥/ml RPAE， IBMX與BRL-50481的LD50值分別為840μM和720μM。
　　 4.泡沫細(xì)胞經(jīng)油紅O染色，細(xì)胞內(nèi)可見明顯紅色脂滴，而對(duì)照組巨噬細(xì)胞組內(nèi)未見

9、紅色脂滴。HPLC分析結(jié)果顯示，泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量為365.2mg/g細(xì)胞蛋白，占總膽固醇57.80％。與巨噬細(xì)胞組對(duì)比，泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量及膽固醇酯/總膽固醇比例均升高。提示泡沫細(xì)胞模型建立成功。
　　 5.膽固醇流出實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RPAE在0.1、1.0和10 mg生藥/ml時(shí)，膽固醇流出率分別為8.04％、11.25％和12.32％。與apoA-1處理組對(duì)比，1 mg/ml RPAE和10 mg/ml RPAE處理

10、組膽固醇流出率明顯升高(p＜0.01)。
　　 6.細(xì)胞PDE-7A活性測(cè)定表明，與apoA-1組對(duì)比，1 mg/ml RPAE和10 mg/mlRPAE處理組PDE-7A活性明顯下降(p＜0.05，p＜0.01)，而cAMP相對(duì)含量升高(p＜0.05，p＜0.01)。
　　 7.Western blot分析顯示:RPAE處理組（0.1、1.0、10 mg生藥/ml）PDE-7A蛋白水平逐漸降低，ABCA1蛋白表達(dá)依次升

11、高。與apoA-1組相比，0.1 mg/mlRPAE組PDE-7A、ABCA1蛋白表達(dá)沒有明顯變化;1.0 mg/ml和10 mg/ml RPAE組PDE-7A表達(dá)降低(p＜0.05，p＜0.01)，而ABCA1蛋白表達(dá)升高(p＜0.05，p＜0.01)。
　　 [結(jié)論]
　　 實(shí)驗(yàn)表明PDE-7A與ABCA1表達(dá)及膽固醇流出呈現(xiàn)負(fù)調(diào)節(jié)作用。RPAE通過抑制PDE-7A蛋白表達(dá)及PDE-7A酶活性，提高細(xì)胞內(nèi)cAMP相對(duì)