基于DNM-1的抗耐藥菌藥物評價模型的建立及實驗誘導腸桿菌科細菌的藥敏分析與機制研究.pdf

1、近十年來，G-桿菌耐藥問題日益嚴重，突出表現(xiàn)在耐碳青霉烯類抗生素的腸桿菌科細菌(Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae，CRE，包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌等)、非發(fā)酵糖細菌（鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌等），其中肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌耐藥最為嚴重，臨床治療困難。
　　 碳青霉烯酶是腸桿菌科細菌等G-桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的重要機制，自1983年

2、在腸桿菌科細菌中首次報道超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)以來，腸桿菌科細菌的耐藥問題日趨嚴重。2001年美國第一次發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC酶)，并很快在美國乃至全球傳播，遍及北美、南美、亞洲、歐洲等幾十個國家和地區(qū)。我國2007年首次報道產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌，造成大范圍流行，并傳播至大腸埃希菌、克雷伯菌等其它腸桿菌科細菌。2009年，英國人首先報道了在印度

3、新德里發(fā)現(xiàn)的第一例產(chǎn)金屬β-內酰胺酶NDM-1的超級耐藥肺炎克雷伯菌株感染病例，其后，美國、加拿大、日本、韓國、澳大利亞和我國香港等地區(qū)相繼有感染病例報道，引起全球高度關注。這種產(chǎn)NDM-1的超級細菌對幾乎所有的臨床常用抗菌藥物包括治療G-桿菌“王牌藥”碳青霉烯類抗生素都呈現(xiàn)耐藥性，僅有粘菌素、替加環(huán)素等極少數(shù)抗生素相對有效，但已出現(xiàn)對粘菌素、替加壞素耐藥的超級耐藥菌。因此，研發(fā)新型抗耐藥菌藥物已迫在眉睫。基于此背景，我們主要進行了以下

4、兩部分研究:
　　 第一部分基于NDM-1的抗耐藥菌藥物評價模型的建立
　　 主要目的是為研發(fā)新型抗產(chǎn)NDM-1細菌藥物奠定基礎。首先，通過分子克隆技術成功構建了NDM-1蛋白外源表達體系，并純化得到重組NDM-1酶。測得NDM-1對美羅培南水解反應的酶動力學參數(shù)(Km=63.3±7.5μM，Kcat=42.6±1.8s-1，Kcat/Km=0.67 s-1/μM)，并驗證了EDTA為NDM-1的抑制劑，而他唑巴坦及克拉

5、維酸不是?；诖耍⒘嗣杆降腘DM-1抑制劑評價模型，并進行了7種化合物活性評價，結果顯示此7種化合物均不能有效抑制NDM-1的活性。此外，構建的全長基因NDM-1轉化子表現(xiàn)出產(chǎn)NDM-1酶菌株應有的對β-內酰胺類藥物（包括碳青霉烯類）耐藥的特性，因此能夠用于在菌體水平進行藥物評價。
　　 第二部分實驗誘導腸桿菌科細菌的藥敏分析與機制研究
　　 該實驗總的目的是為碳青霉烯類抗生素、粘菌素及替加環(huán)素的臨床合理應用提供參

6、考，以期減少或減緩碳青霉烯類耐藥問題，并對臨床治療產(chǎn)NDM-1細菌感染可能引發(fā)的耐藥問題提供前瞻性研究。主要進行了以下兩方面工作:
　　 1.體外誘導大腸埃希菌及肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物敏感性降低及機制研究
　　 目的是擬在實驗室條件下評價碳青霉烯類抗生素能否體外誘導腸桿菌科細菌對其敏感性降低甚至耐藥，并分析機制。首先，大腸埃希菌及肺炎克雷伯菌經(jīng)碳青霉烯體外誘導后分離得到11個突變株。藥敏試驗顯示突變株對誘導用碳青霉

7、烯敏感性顯著降低，且對其他β-內酰胺類藥物（包括其他碳青霉烯類抗生素）敏感性也呈現(xiàn)不同程度的降低;PFGE顯示突變株與親本株同源。通過PCR、DNA測序、外膜蛋白SDS-PAGE、MALDI-TOF/TOF及Real-time PCR等研究發(fā)現(xiàn)菌株對碳青霉烯類抗生素敏感性降低受外排泵、β-內酰胺酶影響不大，而與基因插入失活等機制引起的外膜蛋白（OmpK36、OmpC、NmpC、LamB、OmpF）缺失或表達降低有關。
　　 2.

8、體外誘導產(chǎn)NDM-1肺炎克雷伯菌對粘菌素及替加環(huán)素敏感性降低及機制研究
　　 目的是擬在實驗室條件下評價粘菌素及替加環(huán)素能否體外誘導產(chǎn)NDM-1肺炎克雷伯菌對其敏感性降低甚至耐藥，并分析機制。首先，產(chǎn)NDM-1肺炎克雷伯菌經(jīng)粘菌素或/及替加環(huán)素體外誘導后分離得到突變株;藥敏試驗顯示突變株對粘菌素及替加環(huán)素敏感性顯著降低，并產(chǎn)生（高水平）耐藥。無藥傳代表明突變株對粘菌素敏感性降低呈現(xiàn)不可逆性，而對替加環(huán)素敏感性降低是可逆的。PFG

9、E證實突變株與親本株同源。小鼠腹腔感染試驗顯示雙藥誘導得到的“全耐藥”菌株致病力有所降低，但仍能致死。為探討耐藥產(chǎn)生機制，進行了外膜蛋白SDS-PAGE及菌體總蛋白2-DE試驗。結果表明，細菌對兩種藥物的敏感性降低與外膜蛋白無關，但其機制仍有待研究。
　　 總之，本研究建立了基于NDM-1的抗耐藥菌藥物評價模型，為藥物研發(fā)奠定了基礎。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，腸桿菌科細菌經(jīng)碳青霉烯類抗生素、粘菌素及替加環(huán)素體外誘導后對這些藥物的敏感性降