成釉細(xì)胞瘤相關(guān)基因的篩選和侵襲性生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究擬從以下幾方面展開(kāi)： 一、利用DNA微陣列技術(shù)篩選成釉細(xì)胞瘤相關(guān)基因； 二、用RT-PCR技術(shù)對(duì)成釉細(xì)胞瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的基因進(jìn)行定量驗(yàn)證； 三、對(duì)一些在其他腫瘤明確過(guò)度表達(dá)的基因，在AM中少見(jiàn)或未見(jiàn)有研究者(如EMMPRIN、CXCR4)進(jìn)行初步研究，探討它們?cè)诔捎约?xì)胞瘤侵襲性與增殖活性和微血管密度的關(guān)系第一部分 DNA微陣列篩選成釉細(xì)胞瘤相關(guān)基因的研究研究目的： 成釉細(xì)胞瘤雖然是良性的上皮多

2、形性腫瘤，卻具有局部侵襲性生長(zhǎng)和術(shù)后容易復(fù)發(fā)的生物學(xué)特征。目前有關(guān)其發(fā)病機(jī)理仍不清楚，而有關(guān)其遺傳生物學(xué)特征更是知之甚少。本實(shí)驗(yàn)用生物芯片技術(shù)篩選成釉細(xì)胞瘤相關(guān)基因，以便比較全面的了解與成釉細(xì)胞瘤發(fā)生和發(fā)展有關(guān)的基因概貌，為深入研究成釉細(xì)胞瘤局部侵襲性生長(zhǎng)尋找可靠的路徑。 材料和方法： 總RNA的提取和mRNA的純化： 分別從人成釉細(xì)胞瘤和16-18周人類(lèi)胚胎的牙胚組織中提取總RNA(按標(biāo)準(zhǔn)Trizol試劑Gil

3、bco提取)并純化為mRNA(照Oligotex mRNA純化試劑盒說(shuō)明書(shū))。 cDNA芯片的制備： 包含有14000條已知的全長(zhǎng)或部分序列的cDNA芯片由聯(lián)合基因公司提供(中國(guó)，上海)。芯片中所有目的基因經(jīng)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳驗(yàn)證(在電泳成像儀上拍攝電泳圖譜，并用熱敏打印機(jī)打印出圖譜照片，質(zhì)檢確認(rèn)PcR產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、點(diǎn)樣、封閉制成芯片。兩種組織的mRNA分別逆轉(zhuǎn)錄合成有熒光分子標(biāo)記的

4、探針，然后與含有14000種人類(lèi)基因的芯片進(jìn)行雜交，雜交信號(hào)用ScanArray4000 StandardBiochip Scanning System掃描儀掃描，結(jié)果用芯片圖象分析軟件(GenepixPro3.0)進(jìn)行分析。 結(jié)論：運(yùn)用DNA微陣列可以有效地篩選出成釉細(xì)胞瘤相關(guān)基因?？梢员容^全面的了解與成釉細(xì)胞瘤發(fā)生和發(fā)展有關(guān)的基因概貌，為深入研究成釉細(xì)胞瘤局部侵襲性生長(zhǎng)尋找可靠的路徑。 第二部分成釉細(xì)胞瘤相關(guān)基因RT

5、-PCR檢測(cè) 研究目的:定量檢測(cè)TNF、Ras、CTGF3個(gè)基因mRNA在成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)水平，探討它們與成釉細(xì)胞瘤的相關(guān)關(guān)系，并進(jìn)一步驗(yàn)證我們?cè)诘谝徊糠值难芯拷Y(jié)果。 材料與方法 用10對(duì)臨床配對(duì)成釉細(xì)胞瘤和正常牙囊組織，提取和純化mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在測(cè)定最佳反應(yīng)條件后，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)驗(yàn)證候選基因的表達(dá)情況，結(jié)合內(nèi)參照3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)管家基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。步驟如下1、

6、10對(duì)臨床配對(duì)成釉細(xì)胞瘤和正常牙囊組織，提取總RNA(按標(biāo)準(zhǔn)Trizol試劑Gilbco提取)并純化為mRNA(照Oligorex mRNA純化試劑盒說(shuō)明書(shū))。 2、設(shè)計(jì)并合成TNF、Ras和CTGF的Realtime PCR引物，由上海生物工程有限公司合成。 3、mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA： RNA3ul、隨機(jī)引物1ul、dNTPslul、DEPC水10.5ul65℃溫育10min后加入如下試劑： RNA

7、酶抑制劑0.5ul、Buffer2u1、DTTl ul、MMLV-RT，SPCLlul37℃孵育1h，75℃保溫10min滅活反轉(zhuǎn)錄酶．cDNA樣品于-20℃保存?zhèn)溆谩?4、檢測(cè)模板質(zhì)量、測(cè)定內(nèi)參GAPDH和最佳反應(yīng)條件。 5、實(shí)時(shí)熒光定量PCR．結(jié)合內(nèi)參照3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)管家基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。 6、結(jié)果和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)論: TNF、Ras是與成釉細(xì)胞瘤密切相關(guān)的基因，結(jié)締

8、組織生長(zhǎng)因子可能與成釉細(xì)胞瘤有關(guān)。 第三部分成釉細(xì)胞瘤侵襲性與細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子和微血管密度的關(guān)系 研究目的:檢測(cè)和比較成釉細(xì)胞瘤與牙源性頜骨囊腫組織中的細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)的表達(dá)和微血管分布情況，探討EMMPRIN對(duì)成釉細(xì)胞瘤進(jìn)展過(guò)程中血管形成的影響。方法使用EMMPRIN多克隆抗體和CD3

9、4單克隆抗體，用SP法對(duì)41例成釉細(xì)胞瘤和40例牙源性頜骨囊腫組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，用Weider法對(duì)CD34染色陽(yáng)性的細(xì)胞簇(微血管)密度計(jì)數(shù)。 結(jié)論: EMMPRIN可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)中的基質(zhì)金屬蛋白酶和微血管形成，對(duì)成釉細(xì)胞瘤進(jìn)展過(guò)程產(chǎn)生作用。 第四部分趨化因子受體CXCR4與成釉細(xì)胞瘤增殖活性及微血管密度的關(guān)系 研究目的:探討CXCR4在成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其與微血管密度和成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖活

10、性的相互關(guān)系。 方法: 選取41例成釉細(xì)胞瘤和40例牙源性囊腫的石蠟塊標(biāo)本，運(yùn)用免疫組織化學(xué)SP方法檢測(cè)CXCR4、CD34和Ki-67在這兩種組織中的表達(dá)情況，參照有關(guān)文獻(xiàn)中提及的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算CXCR4和Ki-67在這兩種組織中的陽(yáng)性表達(dá)率，以及Ki-67增殖指數(shù)和微血管密度?！　〗Y(jié)論:1CXCR4在成釉細(xì)胞瘤和牙源性囊腫組織中均有表達(dá)，它們的陽(yáng)性表達(dá)率分別是58.54％(24/41)和35％(14/40)：