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文檔簡(jiǎn)介
1、聚酰胺-胺樹(shù)狀分子(PAMAM)是一類(lèi)新興的納米級(jí)高分子聚合物,因其水溶性好,單分散性,表面具有密集的可修飾基團(tuán)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用作腫瘤靶向載體。將各種生物活性小分子(靶向小分子,化療藥物,熒光素,抗原等)分步引入PAMAM載體可以實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向化療、造影等,但是由于經(jīng)歷多步反應(yīng),各步反應(yīng)條件、效率不一,最終產(chǎn)物均一性、重現(xiàn)性較差;同時(shí),單個(gè)PAMAM表面可修飾位點(diǎn)及溶解性有限,這些問(wèn)題都限制了單分子PAMAM載體的應(yīng)用。解決這一問(wèn)題的辦法之
2、一就是雙分子PAMAM的自我組裝。
本文將含氨基末端的第五代聚酰胺-胺樹(shù)狀分子(G5-PAMAM)首先與乙酸酐反應(yīng),將末端70%氨基?;灾泻蚉AMAM表面大部分氨基,改善其生物體內(nèi)相容性,得到部分?;臉?shù)狀分子G5-Ac;然后,在水溶性碳酰亞胺縮合劑EDC作用下,靶向配基(葉酸FA)和化療藥物配基(甲氨蝶呤MTX)分別與70%酰化的樹(shù)狀分子表面剩余氨基縮合形成酰胺鍵連接,得到G5-Ac-FA和G5-Ac-MTX;接著,用E
3、DC做縮合劑,咪唑作為催化劑,G5-Ac-FA和G5-Ac-MTX表面剩余氨基分別與5’端磷酸修飾的34堿基長(zhǎng)度的互補(bǔ)單鏈寡核苷酸(sON34和cON34)縮合形成磷酰胺共價(jià)連接,得到靶向功能端G5-Ac-FA-sON34和化療藥物功能端G5-Ac-MTX-cON34;最后,G5-Ac-FA-sON34和G5-Ac-MTX-cON34在磷酸緩沖液(PBS)中退火形成雙鏈DNA,得到G5-Ac-FA-DNA-G5-Ac-MTX,實(shí)現(xiàn)了腫瘤
4、靶向功能端和化療藥物功能端的自我組裝。
采用電位滴定,紫外-可見(jiàn)光分光光度法(UV-VIS),核磁共振氫譜(1H-NMR),瓊脂糖凝膠電泳等分析方法對(duì)各步產(chǎn)物進(jìn)行了定性和定量分析。
先用0.1M鹽酸滴定一定量的PAMAM末端氨基,測(cè)得PAMAM末端氨基數(shù)目為117個(gè),然后與70%摩爾比的乙酸酐反應(yīng)得到乙?;腉5-Ac,核磁共振氫譜結(jié)果顯示82個(gè)末端氨基被乙?;?,剩余35個(gè)氨基,?;壤秊?0%。EDC活化后的葉酸/
5、甲氨蝶呤與PAMAM表面剩余氨基縮合,與PAMAM縮合后,葉酸/甲氨蝶呤的紫外吸收光譜有5-10nm的紅移,同時(shí),核磁共振氫譜中6-9ppm出現(xiàn)了新的質(zhì)子信號(hào)峰且峰形變寬,表明葉酸/甲氨蝶呤與PAMAM形成了共價(jià)連接。紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算出每分子PAMAM連上的葉酸/甲氨蝶呤分別為2.4/4.0個(gè),同時(shí),通過(guò)比較核磁共振氫譜中PAMAM末端乙?;|(zhì)子峰和葉酸/甲氨蝶呤結(jié)構(gòu)中蝶啶環(huán)上的芳質(zhì)子峰積分比,計(jì)算出每分子PAMAM連上的葉酸/甲
6、氨蝶呤分別為3.0/5.0個(gè),兩種方法結(jié)果基本一致。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示連有葉酸/甲氨蝶呤的PAMAM與單鏈寡核苷酸sON34/cON34連接后幾乎不帶電荷,由于PAMAM表面剩余氨基數(shù)目大約為32個(gè),在PH8.0緩沖液中PAMAM表面帶32個(gè)正電荷,而sON34/cON34約帶34個(gè)負(fù)電荷,這證明了每分子PAMAM上連接的DNA數(shù)目為1。雜化組裝前G5-Ac-FA-sON34和G5-Ac-MTX-cON34分子量分別約為44k,雜化
7、后得到的G5-Ac-FA-DNA-G5-Ac-MTX為淡橙色透明溶液,可以被截留分子量為100k的濾膜截留,說(shuō)明sON34/cON34與PAMAM之間形成了磷酰胺鍵,而不是通過(guò)正負(fù)電荷中和形成復(fù)合物,sON34與cON34的退火反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了PAMAM雙分子自組裝;同時(shí),比較雜化反應(yīng)前后紫外吸收曲線(xiàn)的變化,發(fā)現(xiàn)在260-280nm處吸收有明顯增加,這一波段是DNA的特征吸收區(qū)域,也佐證了兩分子PAMAM通過(guò)DNA實(shí)現(xiàn)了自組裝。
在
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