自組裝型靶向抗腫瘤聚酰胺-胺樹(shù)狀分子簇的設(shè)計(jì)合成與表征.pdf

1、聚酰胺-胺樹(shù)狀分子（PAMAM）是一類(lèi)新興的納米級(jí)高分子聚合物，因其水溶性好，單分散性，表面具有密集的可修飾基團(tuán)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用作腫瘤靶向載體。將各種生物活性小分子（靶向小分子，化療藥物，熒光素，抗原等）分步引入PAMAM載體可以實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向化療、造影等，但是由于經(jīng)歷多步反應(yīng)，各步反應(yīng)條件、效率不一，最終產(chǎn)物均一性、重現(xiàn)性較差；同時(shí)，單個(gè)PAMAM表面可修飾位點(diǎn)及溶解性有限，這些問(wèn)題都限制了單分子PAMAM載體的應(yīng)用。解決這一問(wèn)題的辦法之

2、一就是雙分子PAMAM的自我組裝。
　　本文將含氨基末端的第五代聚酰胺-胺樹(shù)狀分子（G5-PAMAM）首先與乙酸酐反應(yīng)，將末端70％氨基?；灾泻蚉AMAM表面大部分氨基，改善其生物體內(nèi)相容性，得到部分?；臉?shù)狀分子G5-Ac；然后，在水溶性碳酰亞胺縮合劑EDC作用下，靶向配基（葉酸FA）和化療藥物配基（甲氨蝶呤MTX）分別與70％酰化的樹(shù)狀分子表面剩余氨基縮合形成酰胺鍵連接，得到G5-Ac-FA和G5-Ac-MTX；接著，用E

3、DC做縮合劑，咪唑作為催化劑，G5-Ac-FA和G5-Ac-MTX表面剩余氨基分別與5’端磷酸修飾的34堿基長(zhǎng)度的互補(bǔ)單鏈寡核苷酸（sON34和cON34）縮合形成磷酰胺共價(jià)連接，得到靶向功能端G5-Ac-FA-sON34和化療藥物功能端G5-Ac-MTX-cON34；最后，G5-Ac-FA-sON34和G5-Ac-MTX-cON34在磷酸緩沖液（PBS）中退火形成雙鏈DNA，得到G5-Ac-FA-DNA-G5-Ac-MTX，實(shí)現(xiàn)了腫瘤

4、靶向功能端和化療藥物功能端的自我組裝。
　　采用電位滴定，紫外-可見(jiàn)光分光光度法（UV-VIS），核磁共振氫譜（1H-NMR），瓊脂糖凝膠電泳等分析方法對(duì)各步產(chǎn)物進(jìn)行了定性和定量分析。
　　先用0.1M鹽酸滴定一定量的PAMAM末端氨基，測(cè)得PAMAM末端氨基數(shù)目為117個(gè)，然后與70％摩爾比的乙酸酐反應(yīng)得到乙?；腉5-Ac，核磁共振氫譜結(jié)果顯示82個(gè)末端氨基被乙?；?，剩余35個(gè)氨基，?；壤秊?0％。EDC活化后的葉酸/

5、甲氨蝶呤與PAMAM表面剩余氨基縮合，與PAMAM縮合后，葉酸/甲氨蝶呤的紫外吸收光譜有5-10nm的紅移，同時(shí)，核磁共振氫譜中6-9ppm出現(xiàn)了新的質(zhì)子信號(hào)峰且峰形變寬，表明葉酸/甲氨蝶呤與PAMAM形成了共價(jià)連接。紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算出每分子PAMAM連上的葉酸/甲氨蝶呤分別為2.4/4.0個(gè)，同時(shí)，通過(guò)比較核磁共振氫譜中PAMAM末端乙?；|(zhì)子峰和葉酸/甲氨蝶呤結(jié)構(gòu)中蝶啶環(huán)上的芳質(zhì)子峰積分比，計(jì)算出每分子PAMAM連上的葉酸/甲

6、氨蝶呤分別為3.0/5.0個(gè)，兩種方法結(jié)果基本一致。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示連有葉酸/甲氨蝶呤的PAMAM與單鏈寡核苷酸sON34/cON34連接后幾乎不帶電荷，由于PAMAM表面剩余氨基數(shù)目大約為32個(gè)，在PH8.0緩沖液中PAMAM表面帶32個(gè)正電荷，而sON34/cON34約帶34個(gè)負(fù)電荷，這證明了每分子PAMAM上連接的DNA數(shù)目為1。雜化組裝前G5-Ac-FA-sON34和G5-Ac-MTX-cON34分子量分別約為44k，雜化

7、后得到的G5-Ac-FA-DNA-G5-Ac-MTX為淡橙色透明溶液，可以被截留分子量為100k的濾膜截留，說(shuō)明sON34/cON34與PAMAM之間形成了磷酰胺鍵，而不是通過(guò)正負(fù)電荷中和形成復(fù)合物，sON34與cON34的退火反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了PAMAM雙分子自組裝；同時(shí)，比較雜化反應(yīng)前后紫外吸收曲線(xiàn)的變化，發(fā)現(xiàn)在260-280nm處吸收有明顯增加，這一波段是DNA的特征吸收區(qū)域，也佐證了兩分子PAMAM通過(guò)DNA實(shí)現(xiàn)了自組裝。
　　在