內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激偶聯(lián)炎癥反應(yīng)參與新生大鼠壞死性小腸結(jié)腸炎發(fā)病及魚油保護作用的研究.pdf

1、本論文包括二部分:
　　第一部分：魚油對新生大鼠壞死性小腸結(jié)腸炎腸損傷的保護作用
　　目的:
　　本實驗旨在通過配方奶喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激+ LPS灌胃多因素聯(lián)合構(gòu)建新生大鼠壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)模型,并預(yù)防性口服魚油干預(yù),觀察新生大鼠一般狀況、腸道病理改變、NEC發(fā)病率等指標(biāo)來探討預(yù)防性服用魚油是否對新生大鼠NEC模型腸道有保護作用,為進一步深入機制研究提供實驗基礎(chǔ)。
　　材料與方法:
　　母乳喂養(yǎng)1日

2、齡清潔級Sprague-Dawley(SD)新生大鼠36只,雌雄不限,隨機分為三組,對照組(CON組,n=12),NEC組(NEC組,n=12),魚油干預(yù)組(FO組, n=12)。FO組大鼠乳鼠喂養(yǎng)1周,自生后第一天起每日予魚油(濃度為35％,劑量為0.6ml/100g.d)灌胃一次,持續(xù)7日后予配方奶喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激+ LPS灌胃多因素聯(lián)合方法構(gòu)建NEC模型;NEC組乳鼠喂養(yǎng)1周,自生后第一天起每日予等量生理鹽水灌胃1次,持續(xù)7日后

3、予配方奶喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激+ LPS灌胃多因素聯(lián)合方法構(gòu)建NEC模型;CON組乳鼠喂養(yǎng)實驗始終,自生后第一天起每日插胃管一次,持續(xù)7天。自第8日起NEC組和FO組予配方奶喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激+ LPS灌胃多因素聯(lián)合方法構(gòu)建NEC模型,持續(xù)3日,觀察三組大鼠造模72小時一般狀況、腹脹、糞便等情況及死亡率,并于造模72小時斷頸法處死所有大鼠,留取十二指腸下端至直腸上端腸道組織,觀察腸道大體形態(tài)改變和HE染色病理組織學(xué)檢查結(jié)合腸道組織損傷病理評

4、分比較三組NEC發(fā)病率。
　　結(jié)果:
　　1、三組新生大鼠外觀表現(xiàn)及一般情況:CON組大鼠活動度良好,無腹脹,大便次數(shù)及性狀正常,體重增長良好,皮下脂肪豐滿。NEC組大鼠自造模24小時起相繼出現(xiàn)腹脹、不同程度地解黃綠色粘液稀便,大便次數(shù)增多,活動度下降、反應(yīng)遲鈍、外觀消瘦,呼吸增快,隨著造模時間延長上述表現(xiàn)逐漸加重。FO組大鼠表現(xiàn)介于兩者之間,活動度尚可,大便次數(shù)稍增多,性狀尚可,體重增長緩慢。
　　2、三組大鼠腸道大

5、體形態(tài)、病理改變及腸道組織損傷病理評分比較:CON組大鼠回腸呈淡黃色,彈性佳,無充血、積氣等改變,鏡下見腸道絨毛完整,結(jié)構(gòu)正常。NEC組大鼠腸道發(fā)黑,腸腔不同程度擴張、積氣,腸壁變薄,鏡下觀察見重度黏膜下和固有層分離,不同程度絨毛脫落、壞死、腸腺缺失,大量炎性細胞浸潤等病理改變。FO組大鼠腸道稍擴張,程度較 NEC組輕,鏡下見輕至中度黏膜下、固有層分離,黏膜下水腫,炎性細胞浸潤,局部絨毛脫落。CON組、NEC組、FO組三組大鼠腸道組織損

6、傷病理評分分別為0.16±0.17,2.39±0.51,1.77±0.59,三組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),NEC組腸道組織損傷病理評分比CON組和FO組明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均 P<0.05),FO組腸道組織損傷病理評分顯著高于CON組(P<0.05)。
　　3.三組新生大鼠 NEC發(fā)病率及死亡率比較:CON組大鼠無一例發(fā)生 NEC, NEC組12只新生大鼠中有10只發(fā)生NEC,NEC發(fā)病率為83.33％,FO組

7、12只新生大鼠中有4只發(fā)生 NEC,NEC發(fā)病率為33.33％,其發(fā)病率在三組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與CON組和FO組相比,NEC組其發(fā)病率明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均 P<0.05);與 CON組相比, FO組 NEC發(fā)病率亦顯著升高(P<0.05)。NEC組大鼠中有一例死亡,CON組、FO組無大鼠死亡,三組間死亡率比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、配方奶喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激+LP

8、S灌胃多因素聯(lián)合可成功構(gòu)建NEC模型。
　　2、預(yù)防性口服魚油可降低新生大鼠NEC的發(fā)病率,減輕腸道損傷。
　　第二部分：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激偶聯(lián)炎癥反應(yīng)在新生大鼠壞死性小腸結(jié)腸炎中的作用及魚油保護機制的研究
　　目的:
　　通過魚油預(yù)防干預(yù)、并構(gòu)建新生大鼠壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)模型,動態(tài)研究新生大鼠NEC發(fā)病過程中腸組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)相關(guān)指標(biāo)GRP78、Caspase-12和促炎癥性因子TNF-α、IL-6的表

9、達變化及其與腸道組織損傷的關(guān)系,進一步深入探討ERS及炎癥反應(yīng)在NEC發(fā)病機制中的作用,并試圖揭示預(yù)防應(yīng)用魚油對新生大鼠NEC腸道保護作用的可能作用機制,為臨床預(yù)防和治療NEC提供新思路和實驗依據(jù)。
　　材料與方法:
　　母乳喂養(yǎng)1日齡清潔級Sprague-Dawley(SD)新生大鼠96只,雌雄不限,隨機分為3組,對照組(CON組,n=32)、NEC組(NEC組,n=32)和魚油干預(yù)組(FO組, n=32)。
　　F

10、O組大鼠乳鼠喂養(yǎng)1周,自生后第一天起每日予魚油(濃度為35％,劑量為0.6ml/100g.d)灌胃一次,持續(xù)7日后予配方奶喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激+ LPS灌胃多因素聯(lián)合方法構(gòu)建NEC模型。NEC組大鼠乳鼠喂養(yǎng)1周,自生后第一天起每日予等量生理鹽水灌胃,持續(xù)7日后予配方奶喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激+ LPS灌胃多因素聯(lián)合方法構(gòu)建NEC模型。CON組大鼠乳鼠喂養(yǎng)實驗始終,自生后第一天起每日予插胃管1次,持續(xù)7天。觀察三組大鼠造模0小時、24小時、48小

11、時、72小時各個時間點一般狀況、腹脹、糞便等情況及死亡率;并分別于造模過程中各個時間點隨機取8只處死,留取十二指腸下端至直腸上端腸道組織,觀察腸道大體形態(tài)改變,HE染色病理組織學(xué)檢查結(jié)合腸道組織損傷病理評分比較三組上述時間點腸道損傷程度;取部分腸道組織采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測GRP78和Caspase-12蛋白表達;采用Western-blot技術(shù)檢測Caspase-12蛋白的表達;酶聯(lián)免疫法(Elisa)檢測腸道組織中促炎性因子——I

12、L-6和TNF-α表達。
　　結(jié)果:
　　1、三組新生大鼠外觀表現(xiàn)及體重增長情況:實驗過程中,CON組大鼠活動度良好,無腹脹,大便次數(shù)及性狀正常,體重增長良好,皮下脂肪豐滿。自造模刺激開始后 NEC組大鼠相繼出現(xiàn)腹脹、不同程度地解黃綠色粘液稀便,大便次數(shù)增多,活動度下降、反應(yīng)遲鈍、外觀消瘦,呼吸增快,隨造模時間延長上述表現(xiàn)逐漸加重。FO組大鼠表現(xiàn)介于兩者之間,活動度尚可,大便次數(shù)稍增多,性狀尚可。
　　2、三組新生大鼠

13、腸道大體形態(tài)及腸道組織病理評分比較:CON組大鼠回腸呈淡黃色,彈性可。NEC組大鼠24小時腸道大體形態(tài)外觀基本正常,48小時外觀色澤較深,腸腔有不同程度擴張、腸管彈性差,72小時腸道發(fā)黑,腸腔擴張,腸壁變薄。FO組大鼠24、48小時腸道大體形態(tài)外觀基本正常,72小時腸道稍擴張,少數(shù)有積氣。隨著造模時間延長,NEC組和 FO組腸道組織損傷病理評分逐漸增加, NEC組在24、48、72小時三個時間點腸道組織損傷病理評分均高于 CON組和 F

14、O組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均 P<0.05)。FO組在24、48、72小時三個時間點腸道組織損傷病理評分均高于CON組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　3、三組新生大鼠腸道組織中ERS相關(guān)分子——Caspase-12蛋白的動態(tài)表達:隨著造模時間延長,NEC組和 FO組腸道組織中 Caspase-12蛋白表達呈遞增趨勢,從24小時開始升高,于72小時達高峰。NEC組在24、48、72小時三個時間點腸道組織中 Caspase-

15、12蛋白的表達均高于 CON組和 FO組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。FO組在24、48、72小時三個時間點腸道組織中 Caspase-12蛋白的表達均高于CON組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　4、三組新生大鼠腸道組織中 ERS相關(guān)分子——GRP78蛋白的動態(tài)表達:隨著造模時間延長,NEC組和 FO組兩組腸道 GRP78的表達呈遞增趨勢,從24小時開始升高,48小時達高峰,72小時仍持續(xù)高表達。 NEC組在

16、24、48、72小時三個時間點腸道組織 GRP78的表達均高于 CON組和 FO組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。FO組在24、48、72小時三個時間點腸道組織GRP78的表達均高于CON組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　5、三組新生大鼠腸道 TNF-α、IL-6的動態(tài)表達:隨著造模時間延長, NEC組和 FO組兩組腸道 TNF-α、IL-6的表達逐漸升高,并于72小時達高峰。NEC組在48、72小時兩個時間點腸

17、道組織TNF-α、IL-6的表達均高于CON組和FO組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。FO組在48、72小時兩個時間點腸道組織 TNF-α、IL-6的表達均高于CON組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　6、腸道組織中 TNF-α、IL-6、Capase-12的表達水平和腸道損傷病理評分的相關(guān)性分析:腸道組織 IL-6的表達水平和腸道組織損傷病理評分呈正相關(guān)關(guān)系,直線等級相關(guān)系數(shù)為0.914(P<0.01);腸道組織TN

18、F-α的表達水平和腸道組織損傷病理評分呈正相關(guān)關(guān)系,直線等級相關(guān)系數(shù)為0.894(P<0.01),腸道組織Caspase-12的表達水平和腸道組織損傷病理評分呈正相關(guān)關(guān)系,直線等級相關(guān)系數(shù)為0.926(P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.腸道組織ERS相關(guān)指標(biāo)——GRP78、Caspase-12和促炎癥性因子TNF-α、IL-6在NEC模型組中均表達升高,且隨造模刺激時間延長呈進行性升高,并與腸道損傷程度呈正相關(guān),提示ER