PERK-eIF2а-CHOP信號通路參與新生大鼠壞死性小腸結(jié)腸炎發(fā)病及魚油保護作用的機制研究.pdf

1、目的：分別通過魚油、eIF2а去磷酸化抑制劑salubrinal干預(yù)，采用配方奶喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激+LPS灌胃多因素聯(lián)合構(gòu)建壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）新生大鼠模型，動態(tài)研究新生大鼠NEC發(fā)病過程中腸道組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）中PERK/eIF2а/CHOP信號通路中相關(guān)分子PERK、p-PERK、eIF2а、p-eIF2а、CHOP的表達，進一步深入探討ERS信號通路在NEC發(fā)病

2、機制中的作用，并試圖揭示魚油對新生大鼠NEC腸道保護作用的可能分子機制，為臨床防治NEC提供新思路和實驗依據(jù)。
　　方法：240只母乳喂養(yǎng)1日齡清潔級Sprague-Dawley(SD)新生大鼠，體質(zhì)量5-10 g，雌雄不限，母乳喂養(yǎng)至7日齡，體質(zhì)量13-18 g，隨機分為六組：NEC組（NEC組，n=40）、魚油干預(yù)組（FO組，n=40）、Salubrinal干預(yù)組（SAL組，n=40）、Salubrinal+魚油聯(lián)合干預(yù)組（S

3、F組，n=40）、對照組（CON1組，n=40）和二甲基亞砜對照組（CON2組，n=40）。NEC組：于生后第8天開始每天采用配方奶喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激+LPS灌胃多因素聯(lián)合方法連續(xù)3天構(gòu)建NEC模型，造模同時每日予生理鹽水（NS）（0.6ml/100g.d）灌胃、腹腔內(nèi)注射NS(1ml/100g.d)各一次；FO組：于生后第8天開始連續(xù)3天建立NEC模型（方法同上），造模同時每日予魚油（濃度為35％，劑量為0.6ml/100g.d）灌胃

4、、腹腔內(nèi)注射等量NS各一次；SAL組：于生后第8天開始連續(xù)3天建立NEC模型（方法同上），造模同時每日等量NS灌胃、Salubrinal(1 mg/kg)腹腔注射各一次；SF組：于生后第8天開始連續(xù)3天建立NEC模型（方法同上），造模同時每日魚油（濃度為35%，劑量為0.6ml/100g.d）灌胃、Salubrinal(1 mg/kg)腹腔注射各一次；CON1組：7日齡新生SD大鼠繼續(xù)母乳喂養(yǎng)，并于生后第8天開始連續(xù)3天每日予等量NS灌

5、胃、腹腔內(nèi)注射等量NS各一次；CON2組：7日齡新生SD大鼠繼續(xù)母乳喂養(yǎng)，并于生后第8天開始連續(xù)3天每日予等量NS灌胃、腹腔內(nèi)注射1%DMSO(1ml/100g.d)各一次。觀察六組新生大鼠造模0小時、12小時、24小時、48小時、72小時五個時間點一般情況及72小時NEC發(fā)病率；并分別于造模過程中各時間點隨機取8只處死，留取十二指腸下端至直腸上端腸道組織，觀察腸道大體形態(tài)改變，取回盲部近端腸道組織HE染色病理組織學(xué)檢查結(jié)合腸道組織損傷

6、病理評分評估腸道損傷程度，采用Western-blot技術(shù)檢測PERK、p-PERK、eIF2а、p-eIF2а、CHOP蛋白表達水平，并采用RT-PCR技術(shù)檢測CHOP基因表達水平。
　　結(jié)果：⑴六組新生大鼠外觀表現(xiàn)及一般情況：實驗過程中，CON1組和CON2組新生大鼠活動度良好，體重增長良好，皮下脂肪豐滿，無腹脹，大便次數(shù)及性狀正常；自造模刺激開始后NEC組大鼠相繼出現(xiàn)活動度下降，反應(yīng)遲鈍，倦怠，呼吸增快，體重增長緩慢，皮下脂

7、肪減少，皮膚松弛，腹脹，不同程度地解黃綠色粘液稀便，大便次數(shù)增多，隨造模時間延長上述表現(xiàn)漸加重；SAL組、SF組和FO組大鼠表現(xiàn)介于兩者之間，活動度尚可，大便次數(shù)稍增多，性狀尚可。⑵六組新生大鼠腸道大體形態(tài)、病理觀察及腸道損傷病理評分比較：CON1組、CON2組兩組新生大鼠腸道呈淡黃色，腸壁光滑完整，彈性可，無腸道發(fā)黑、腸腔擴張等； NEC組新生大鼠腸道呈暗紫色或黑色，腸腔擴張，腸壁變薄，局部有血栓形成； SAL組、SF組、FO組三組腸

8、道稍發(fā)黑、擴張，少數(shù)有積氣；SF組、FO組兩組腸道大體形態(tài)較SAL組稍改善。HE染色后光鏡下觀察見CON1組、CON2組兩組各時間點腸粘膜絨毛完整，結(jié)構(gòu)正常；NEC組從12小時開始出現(xiàn)輕度粘膜下和/或固有層腫脹分離，漸進展為72小時局部腸絨毛脫落伴壞死，中重度粘膜層、固有層分離，炎性細胞浸潤等改變；SAL組、SF組、FO組三組從24小時開始出現(xiàn)輕度粘膜下和/或固有層腫脹分離，漸進展為72小時時局部腸絨毛脫離，輕中度粘膜層、固有層分離，炎

9、癥細胞浸潤等改變；與CON1組、CON2組比較，NEC組腸道損傷病理評分在12、24、48、72小時均顯著升高（均P<0.05），SAL組、SF組、FO組三組病理評分在24、48、72小時均顯著升高（均P<0.05）；與NEC組相比，SAL組、SF組、FO組三組病理評分在12、24、48、72小時均顯著降低（均P<0.05）。⑶六組新生大鼠72小時NEC發(fā)病率比較：CON1組和CON2組新生大鼠無一例發(fā)生NEC；NEC組有7只發(fā)生NEC

10、，其發(fā)病率為87.5%；SAL組有4只發(fā)生NEC，其發(fā)病率為50%；SF組有3只發(fā)生NEC，其發(fā)病率為37.5%；FO組有3只發(fā)生NEC，其發(fā)病率為37.5%。與CON1組、CON2組相比，NEC組、SAL組、SF組和FO組四組NEC發(fā)病率均顯著升高（均P<0.01）；與NEC組相比，SAL組、SF組和FO組三組NEC發(fā)病率均顯著降低（均P<0.01）。⑷六組新生大鼠腸道組織中PERK、p-PERK蛋白動態(tài)表達水平比較：CON1組、CO

11、N2組、NEC組、SAL組、SF組和FO組六組組間及組內(nèi)不同時間點PERK蛋白的表達均無明顯差異(均P>0.05)；CON1組、CON2組兩對照組組內(nèi)不同時間點p-PERK蛋白的表達均無顯著差異(均P>0.05)；NEC組、SAL組p-PERK蛋白表達在12小時開始升高，且隨造模時間延長呈遞增趨勢，于72小時達峰；SF組、FO組p-PERK蛋白表達在12小時開始升高，24小時達到高峰后呈下降趨勢；與對照組相比，NEC組、SAL組、SF組

12、、FO組四組p-PERK蛋白表達在12、24、48、72小時四個時間點均增高（均P<0.05)；與NEC組相比，SAL組p-PERK蛋白表達在12、24、48、72小時四個時間點均無明顯差異（均P>0.05），SF組、FO組兩組p-PERK蛋白表達在12、24、48、72小時四個時間點均降低（均P<0.05)；與SAL組相比，SF組、FO組兩組p-PERK蛋白表達在12、24、48、72小時四個時間點均降低（均P<0.05)；SF組、F

13、O組兩組p-PERK蛋白表達相比在12、24、48、72小時四個時間點均無明顯差異（均P>0.05）。⑸六組新生大鼠腸道組織中eIF2а、p-eIF2а蛋白動態(tài)表達水平比較：CON1組、CON2組、NEC組、SAL組、SF組和FO組六組組間及組內(nèi)不同時間點eIF2а蛋白表達均無顯著差異(均P>0.05)；兩對照組組內(nèi)不同時間點p-eIF2а蛋白表達均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；NEC組、SAL組、SF組和FO組四組p-eIF2а蛋白

14、表達在12小時開始升高，且隨造模時間延長呈遞增趨勢，于72小時達峰；與對照組相比，NEC組、SAL組、SF組和FO組四組p-eIF2а蛋白表達在12、24、48、72小時四個時間點均增高（均P<0.05)；與NEC組比較，SAL組p-eIF2а蛋白表達在0、12小時無顯著差異（P>0.05），而在24、48、72小時明顯增高（均P<0.05），SF組、FO組兩組p-eIF2а蛋白表達在12、24、48、72小時四個時間點均降低（均P<0

15、.05）；與SAL組相比，SF組、FO組兩組p-eIF2а蛋白表達在12、24、48、72小時四個時間點均降低（均P<0.05)；SF組、FO組兩組p-eIF2а蛋白表達相比在12、24、48、72小時四個時間點均無明顯差異（均P>0.05）。⑹六組新生大鼠腸道組織中CHOP蛋白動態(tài)表達水平比較：CON1組、CON2組兩對照組組內(nèi)不同時間點CHOP蛋白的表達均無明顯差異(均P>0.05)；NEC組CHOP蛋白表達在12小時即明顯升高，且

16、隨造模時間延長呈遞增趨勢，于72小時達峰；SAL組CHOP蛋白表達在24小時即明顯升高，且呈遞增趨勢，于72小時達峰；SF組、FO組CHOP蛋白表達在24小時稍升高，與12小時比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），自48小時起CHOP蛋白表達明顯升高，于72小時達峰；與對照組比較，NEC組CHOP蛋白表達在12、24、48、72小時均增高（均P<0.05)，SAL組CHOP蛋白表達在24、48、72小時增高（均P<0.05)，SF組、F

17、O組兩組CHOP蛋白表達在48、72小時表達增高（均P<0.05)；與NEC組相比，SAL組、SF組和FO組三組CHOP蛋白表達在12、24、48、72小時均降低（均P<0.05)；與SAL組相比，SF組、FO組兩組CHOP蛋白表達在24、48、72小時三個時間點均降低（均P<0.05)；SF組、FO組兩組CHOP蛋白表達相比在12、24、48、72小時四個時間點均無明顯差異（均P>0.05）。⑺六組新生大鼠腸道組織中CHOPmRNA基

18、因動態(tài)表達水平比較：CON1組、CON2組兩對照組組內(nèi)不同時間點CHOPmRNA的表達均無明顯差異(均P>0.05)；NEC組CHOPmRNA表達在12小時開始明顯升高，且隨造模時間延長呈遞增趨勢，于72小時達峰；SAL組CHOPmRNA表達在12小時即明顯升高，且隨造模時間延長表達逐漸增高，于72小時達峰；SF組、FO組CHOPmRNA表達在12小時稍增高，自24小時起CHOP mRNA表達明顯升高，于72小時達峰。組間比較：與對照組

19、相比，NEC組、SAL組兩組CHOPmRNA表達在12、24、48、72小時均增高（均P<0.05)，而SF組、FO組兩組CHOPmRNA表達則在24、48、72小時增高（均P<0.05）；與NEC組相比，SAL組、SF組和FO組三組CHOPmRNA表達在12、24、48、72小時均降低（均P<0.05)；與SAL組相比，SF組CHOPmRNA表達在24、48、72小時三個時間點均降低（均P<0.05)；FO組CHOPmRNA表達在24

20、、72小時兩個時間點均降低（均P<0.05)；SF組、FO組兩組CHOPmRNA表達相比在12、24、48、72小時四個時間點均無明顯差異（均P>0.05）。
　　結(jié)論：①配方奶喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激+LPS灌胃等多種致病危險因素可成功構(gòu)建NEC模型。②腸道組織ERS的PERK/eIF2а/CHOP信號通路相關(guān)分子p-PERK、p-eIF2а、CHOP蛋白及CHOPmRNA基因的表達在NEC模型組中均升高，且隨造模刺激時間延長呈進行性

21、升高；而SAL組中p-eIF2а蛋白表達升高、CHOP蛋白及CHOPmRNA的表達降低，NEC大鼠腸道損傷改善，提示PERK/eIF2а/CHOP信號通路參與新生大鼠NEC的發(fā)生、發(fā)展，而salubrinal可能通過抑制ERS信號通路中p-eIF2а去磷酸化、抑制CHOP基因及蛋白的表達而起作用。③魚油能降低 NEC大鼠腸道組織中 p-PERK、p-eIF2а、CHOP蛋白及CHOPmRNA基因的表達，減輕NEC大鼠腸道損傷的程度，提示