青蒿琥酯對宮頸癌U14細胞體內外生長增殖及移植瘤小鼠外周免疫抑制分子表達的影響.pdf

1、目的：目前宮頸癌發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中占第二位，發(fā)病年齡逐年降低，嚴重危害女性身心健康。宮頸癌的治療模式仍以手術為主，放化療為輔。但手術創(chuàng)傷大，放化療不良反應明顯，且均可進一步損傷機體免疫功能。為此，尋找既能殺傷宮頸癌細胞又對患者免疫功能無加重損害的治療方法已成為研究關注點。青蒿琥酯是一種公認的抗瘧類藥物，但研究發(fā)現(xiàn)其對結直腸癌、肝癌、卵巢癌等均具有明顯的多靶點抗瘤活性。本研究通過體內外實驗分析青蒿琥酯（ART）對小鼠宮頸癌 U

2、14細胞生長增殖及移植瘤小鼠免疫功能的影響，從抑制 U14細胞增殖及逆轉腫瘤免疫抑制的角度探討青蒿琥酯的抗宮頸癌作用機制，為其在臨床廣泛應用提供相應理論支持。
　　方法：
　　1 MTT法分析ART對U14細胞體外生長增殖的影響：U14細胞以不同的細胞濃度（2.5×104/mL、2×105/mL、1.0×106/mL）進行培養(yǎng)，采用MTT法測定培養(yǎng)不同時間（12h、24h、36h、48h、60h、72h）后細胞生長增殖的 A

3、492值，確定 U14細胞最佳接種濃度及培養(yǎng)時間。以確定的接種濃度及培養(yǎng)時間作為實驗條件，檢測不同濃度（4.69ug/mL-600ug/mL）青蒿琥酯對U14細胞體外增殖的抑制作用，并計算相對抑制率。
　　2 U14移植瘤小鼠動物模型的建立及實驗分組：以5×107/mL U14細胞懸液，接種于小鼠左后肢近背部皮下（0.2mL/只）制備小鼠移植瘤模型。成瘤且瘤直徑>5mm的小鼠進行后續(xù)實驗。將造模成功的移植瘤小鼠隨機分為3組：1、腫

4、瘤對照組；2、ART治療組；3、順鉑（DDP）對照組，每組80只。同時設立同周齡健康的無移植瘤小鼠作為正常對照組。連續(xù)治療7日后，各組再隨機分為4組，每組20只，分別于第10d、20d、30d、40d處死。
　　3給藥方法：小鼠腫瘤直徑>5mm時開始給藥，共治療7d。根據(jù)人體使用劑量換算，ART治療組小鼠肌肉注射ART（20mg/kg/d，0.2mL/次）；DDP對照組小鼠腹腔注射順鉑（2mg/kg/d，0.2mL/次）；腫瘤對照

5、組及正常對照組小鼠給予等量的0.9％生理鹽水肌注。
　　4小鼠移植瘤生長狀況觀察：從接種腫瘤細胞之日起每日觀察小鼠一般情況（精神、飲食、體重、活動、毛發(fā)、皮膚等）及移植瘤生長情況。每10d測小鼠體重、移植瘤的最長徑和最短徑，計算腫瘤體積；處死日剝瘤稱取瘤重，計算抑瘤率。觀察各組小鼠存活天數(shù)，并計算生命延長率。
　　5 MTT法檢測脾T淋巴細胞誘導轉化：小鼠處死日無菌取脾稱量脾重，計算脾指數(shù)，行小鼠脾T淋巴細胞ConA誘導轉化

6、實驗，計算T淋巴細胞體外刺激指數(shù)SI。
　　6 ELISA法測定小鼠血清免疫抑制分子表達：小鼠處死日當天收集血清，嚴格按ELISA試劑盒操作，檢測各組小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β1、PGE2含量。
　　結果：
　　1 U14細胞培養(yǎng)濃度及培養(yǎng)時間的確定
　　初始培養(yǎng)濃度為2×105/mL時，生長增殖曲線良好而穩(wěn)定，于36h完全覆蓋瓶底，48h后培養(yǎng)液開始變黃，pH值逐漸降低，確定此初始濃度

7、下培養(yǎng)36h為最佳培養(yǎng)條件。
　　2 ART對U14細胞體外生長增殖的影響
　　與未經(jīng)ART作用的腫瘤細胞對照組A492值（0.913±0.265）相比，濃度在37.5ug/mL-600ug/mL之間的ART作用后可使U14細胞生長增殖的A492值呈漸進性顯著降低（分別為0.688±0.097、0.678±0.172、0.519±0.086、0.418±0.062、0.063±0.039，均P<0.05），相對抑制率呈遞進性

8、升高（分別為24.64%、25.74%、43.15%、54.22%、93.10%）。而當ART作用濃度≤18.75ug/mL時，A492值與未經(jīng)ART作用的腫瘤細胞對照組相比無明顯差異。相關性分析顯示，ART作用濃度與 A492值之間呈顯著負相關（r=-0.971，P=0.000），與相對抑制率之間呈顯著正相關（r=0.988， P=0.000）。
　　3 ART對小鼠移植瘤生長狀況的影響
　　小鼠皮下接種U14細胞3-5天

9、后成瘤，成瘤率100%。局部皮膚于接種后10d內呈破潰、流膿等明顯的炎癥反應。腫瘤對照組小鼠精神萎靡，進食量少、睡眠較差，晚期呈消瘦狀態(tài)，體重與正常對照組相比顯著下降（均P<0.05）。DDP對照組小鼠反應差，毛發(fā)晦暗無光澤，食欲差，排便、排尿次數(shù)少，呈消瘦狀態(tài)，體重與正常對照組相比顯著下降（均P<0.05）,且與腫瘤對照組相比10d組體重顯著降低（P<0.05），20d、30d、40d組相比均無明顯差異。ART治療組小鼠精神、飲食、睡

10、眠等均較正常對照組小鼠無顯著差異，各時間段小鼠體重較腫瘤對照組及DDP對照組均有顯著回升（均 P<0.05），與正常對照組小鼠相比20d、40d組體重顯著降低（均P<0.05），10d、30d組體重無明顯改變。各組小鼠體重大致呈現(xiàn)為DDP對照組<腫瘤對照組　　與腫瘤對照組相比，各時間段內兩治療組小鼠瘤體積有下降趨勢， DDP對照組小鼠在第10d時瘤體積明顯低于腫瘤對照組（P<0.05），其他

11、時間段比較均無統(tǒng)計學差異；DDP對照組小鼠瘤體積較ART治療組下降明顯，但差異不顯著。與腫瘤對照組小鼠各時間段瘤重相比，兩治療組均較其明顯下降（均P<0.05），DDP對照組瘤重于第10d明顯低于ART治療組（P<0.05）。瘤體積、瘤重呈現(xiàn)為 DDP對照組　　ART治療組及DDP對照組小鼠生存時間與腫瘤對照組小鼠（38.0±2.79）d相

12、比，均明顯延長（均 P<0.05）；ART治療組生存時間（44.8±3.25）d較DDP對照組（47.3±3.89）d偏低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。小鼠生命延長率DDP對照組（24.47%）高于ART治療組（17.89%）。
　　4 ART對小鼠脾淋巴細胞誘導增殖的影響
　　腫瘤對照組及兩治療組脾指數(shù)隨時間推移均有降低趨勢。腫瘤對照組小鼠在第10d時脾指數(shù)較正常對照組明顯增高（P<0.05），其他時間點均有不同程度

13、降低，但與正常對照組相比差異不顯著（均P>0.05）。DDP對照組在第10d脾指數(shù)較正常對照組明顯升高（P<0.05），在第40d時值較正常對照組顯著降低（P<0.05），在20d、30d與正常對照組相比無差異；其各時間段值與腫瘤對照組相比均有所降低，在第40d時兩組相比有明顯差異（P<0.05）。ART治療組從第20d開始脾指數(shù)較 DDP對照組有一明顯回升（P<0.05），且在第20d時顯著高于腫瘤對照組（P<0.05），在第10d、

14、20d時較正常對照組顯著增高（P<0.05）。自20d后脾指數(shù)值呈現(xiàn)為DDP對照組<腫瘤對照組<正常對照組　　腫瘤對照組及DDP對照組第20d、30d、40d的T淋巴細胞體外刺激指數(shù) SI明顯低于正常對照組（均 P<0.05），DDP對照組第10d、20d的SI值明顯低于腫瘤對照組（均 P<0.05）。ART治療組第20d、30d、40d的SI值較腫瘤對照組明顯回升（均P<0.05）；第10d、20d、

15、40d時與DDP對照組相比SI也明顯回升（均P<0.05）；第30d時SI值較正常對照組明顯降低（P<0.05），其他時間段兩組比較均無差異（均 P>0.05）。自20d起SI值大致呈現(xiàn)為DDP對照組<腫瘤對照組　　5 ART對小鼠血清免疫抑制分子表達的影響
　　與正常小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β1、PGE2含量相比，腫瘤對照組及兩治療組中各時間段內上述含量均明

16、顯升高（ P<0.05）。經(jīng)ART、DDP治療后的小鼠血清中 IL-4、IL-6含量與腫瘤對照組相比無明顯差別（均P>0.05）。DDP對照組與腫瘤對照組相比，IL-10含量無明顯差異；ART治療后，小鼠血清中IL-10含量較腫瘤對照組及DDP對照組明顯降低（均 P<0.05）。兩治療組小鼠血清中 TGF-β1、PGE2含量與腫瘤對照組相比較均明顯降低（均P<0.05），且ART治療組中TGF-β1、PGE2含量均低于DDP對照組（均P

17、<0.05）。
　　結論：
　　1 ART有抑制宮頸癌U14細胞體內外增殖的作用，且隨著ART作用濃度的增加，抑制作用逐漸增強。
　　2 ART可通過增強U14荷瘤小鼠T淋巴細胞功能發(fā)揮抗瘤活性。
　　3 ART通過下調U14荷瘤小鼠血清中IL-10、TGF-β1、PGE2分泌而有效逆轉腫瘤免疫抑制，從而發(fā)揮針對宮頸癌的抗瘤活性。
　　4 ART及DDP對U14移植瘤生長均有抑制作用，但ART對T淋巴細胞功