腫瘤細(xì)胞膜上核苷載體的熒光標(biāo)記、分析及實用性研究.pdf

1、本論文利用熒光分析法對細(xì)胞膜上的核苷載體進(jìn)行了標(biāo)記與定量分析研究,主要內(nèi)容包括:提出用潘生丁作為熒光標(biāo)記物測定細(xì)胞膜上的核苷載體的新方法.實驗考察了潘生丁的熒光光譜特性,探討了溶液pH值、溫度、放置時間等因素對潘生丁熒光強(qiáng)度的影響,優(yōu)化了潘生丁測定的實驗條件.在優(yōu)化實驗條件下,潘生丁的濃度與其熒光強(qiáng)度在1.0×10<'-12>到1.0×10<'-9>M之間呈線性,線性方程為F=1.37+17.3×C,相關(guān)系數(shù)為0.997,方法的最低檢出

2、限為2.8×10<'-13>M,樣品在濃度為1.0×10<'-12>-1.0×10<'-9> M之間測定的平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7％(n=9).潘生丁與胰腺腫瘤細(xì)胞孵育30分鐘后,測得細(xì)胞膜樣品溶液中潘生丁的濃度為2.9(±.24)×10<'-11>M,單個細(xì)胞表面上與潘生丁結(jié)合的核苷載體的數(shù)量為1.75(±0.14)×10<'5>個.與其它核苷載體的定量分析方法相比,本方法簡單方便,靈敏度高,不存在放射危害.潘生丁除了作為核苷載體EN

3、T的高效熒光標(biāo)記物之外,它還是一種核苷載體ENT的阻斷劑.在標(biāo)記核苷載體ENT的同時,還能發(fā)揮阻斷作用,阻止進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的核苷類抗腫瘤藥物順濃度梯度流出細(xì)胞外,并從而可望提高聯(lián)合化療的療效.具有其他核苷載體ENT阻斷劑所不可替代的優(yōu)點.為了考察潘生丁對阻斷核苷載體ENT的作用,建立了細(xì)胞內(nèi)核苷衍生物類藥物6-巰基嘌呤的測定方法.考察了6-巰基嘌呤的熒光光譜特性,研究了溶液pH值、溫度、放置時間等因素對6-巰基嘌呤熒光強(qiáng)度的影響,獲得6

4、-巰基嘌呤測定的優(yōu)化條件.6-巰基嘌呤的濃度與其熒光強(qiáng)度在4.0×10<'-11>到4.0×10<'-6>M之間呈線性,相關(guān)系數(shù)為0.9997,線性方程為F=95.8C+1.6,方法的最低檢出限為8.2×10<'-12> M,樣品在濃度為4.0×10<'-12>-4.0×10<'-6>M之間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.3％(n=9).6-巰基嘌呤與胰腺腫瘤細(xì)胞孵育60分鐘后,計算出實驗樣品溶液中細(xì)胞內(nèi)6-巰基嘌呤的濃度為2.38±0.088 n

5、M.方法簡單方便,靈敏度和精密度高.可作為臨床細(xì)胞內(nèi)6-巰基嘌呤測定的一種參照方法.本研究考察了作為核苷載體阻斷劑的潘生丁對細(xì)胞膜上核苷載體轉(zhuǎn)運6-巰基嘌呤的影響.胰腺腫瘤細(xì)胞在體外與潘生丁孵育時,孵育初期細(xì)胞膜上潘生丁的濃度迅速提高,30分鐘后達(dá)到結(jié)合平衡.固定孵育時間30分鐘,細(xì)胞膜上潘生丁的濃度隨細(xì)胞外潘生丁濃度的增加而增加,細(xì)胞外潘生丁濃度達(dá)200 μM后趨于結(jié)合平衡并由此測算出20℃時潘生丁在胰腺腫瘤細(xì)胞膜上的結(jié)合常數(shù)為4.7

6、(±0.53)×10<'10>M<'-1>.未加潘生丁的6-巰基嘌呤在與胰腺腫瘤細(xì)胞孵育60分鐘,細(xì)胞外6-巰基嘌呤的濃度在60 μM時細(xì)胞內(nèi)6-巰基嘌呤的濃度達(dá)到飽和.加入潘生丁后觀察到細(xì)胞內(nèi)6-巰基嘌呤的濃度比未加前的濃度提高了0.49倍,前后實驗結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(p<0.05),實驗結(jié)果驗證了潘生丁對核苷載體阻斷的機(jī)制是對ENT的阻斷而非對CNT的阻斷.潘生丁通過對平衡型ENT的阻斷,防止了ENT把6-巰基嘌呤從細(xì)胞內(nèi)泵出;