多巴胺D2樣受體激動(dòng)對(duì)多巴胺能細(xì)胞自噬的調(diào)控及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究多巴胺D2樣受體激動(dòng)劑對(duì)多巴胺能細(xì)胞自噬水平和α-synuclein等易聚集蛋白降解的調(diào)控及其分子機(jī)制。
　　方法：離體實(shí)驗(yàn)以多種多巴胺能細(xì)胞株如PC12、MES23.5、SH-SY5Y和原代培養(yǎng)的大鼠中腦神經(jīng)元為工具細(xì)胞，其中PC12細(xì)胞為主要研究對(duì)象；以多巴胺受體激動(dòng)劑普拉克索和喹吡羅，以及多巴胺 D2、D3受體特異性拮抗劑為工具藥;Western Blot檢測(cè)各種蛋白的表達(dá)或磷酸化水平的變化；用維甲酸(RA)聯(lián)合佛

2、波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(TPA)誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分化；普通和定量PCR檢測(cè)不同細(xì)胞內(nèi)D2樣受體和BECN1的mRNA水平變化；CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力,以cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平變化評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡情況；激光共聚焦觀察細(xì)胞內(nèi)EGFP-LC3、GFP-RFP-LC3點(diǎn)狀聚集和多巴胺D2、D3亞型受體的定位和分布情況；透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬小體的形成情況；鈣成像儀動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子水平；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)干擾

3、和過(guò)表達(dá)Beclin1以及c-Fos；免疫共沉淀（Co-IP）觀察Beclin1和PtdIns3K蛋白相互作用情況；染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）觀察c-Fos蛋白和BECN1啟動(dòng)子的結(jié)合情況；熒光素酶雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BECN1啟動(dòng)子的活性；以攜帶WT和A53T、A30P突變型SNCA的慢病毒感染PC12細(xì)胞誘導(dǎo)α-synuclein過(guò)表達(dá)；以攜帶Htt-552-18Q、Htt-552-100Q的腺病毒感染PC12細(xì)胞誘導(dǎo)Htt-552蛋白過(guò)

4、表達(dá)。在體以15月齡的野生型和 A53T-SNCA轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對(duì)象；以腹腔注射0.5 mg/kg的普拉克索，每天注射兩次，持續(xù)3周給藥，用等體積的生理鹽水作為陰性對(duì)照組。3周后，分離黑質(zhì)和紋狀體組織，用常規(guī)western blotting檢測(cè)各蛋白的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.多巴胺細(xì)胞中多巴胺 D2樣受體的表達(dá)情況：PC12細(xì)胞主要表達(dá)多巴胺D2受體，MES23.5細(xì)胞上同時(shí)表達(dá)多巴胺D2及D3受體，低分化的SH-

5、SY5Y細(xì)胞上很少表達(dá)多巴胺D2受體，D3受體幾乎不表達(dá)，RA/TPA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分化后多巴胺D2受體表達(dá)有所增加，D3受體則明顯增加。
　　2. D2樣受體激動(dòng)劑對(duì)細(xì)胞自噬水平及存活的影響：1）與對(duì)照組相比，多巴胺D2樣受體激動(dòng)劑普拉克索在一定劑量范圍內(nèi)（10-100μM）呈濃度和時(shí)間依賴性地促使PC12、MES23.5和誘導(dǎo)分化的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)LC3-II和Beclin1蛋白表達(dá)增加、而P62蛋白水平明顯下降；

6、喹吡羅（另一個(gè)經(jīng)典的多巴胺D2樣受體激動(dòng)劑）作用于PC12細(xì)胞后也觀察到類似的現(xiàn)象；而普拉克索右旋對(duì)映體（幾乎無(wú)多巴胺D2樣受體激動(dòng)活性）作用于 PC12細(xì)胞未觀察到上述蛋白水平的變化。普拉克索（100μM）作用于未分化的SH-SY5Y（多巴胺D2樣受體表達(dá)較低）也未觀察到上述蛋白水平的變化；巴弗洛霉素 A1(抑制自噬體和溶酶體融合)和氯喹（抑制溶酶體酶活性）存在時(shí)，普拉克索和喹吡羅仍然可以增加LC3-II水平；上述兩個(gè)多巴胺D2樣受體

7、激動(dòng)劑作用于PC12細(xì)胞后，LAMP1和LAMP2蛋白水平均無(wú)變化。2）免疫熒光觀察到普拉克索作用的PC12細(xì)胞內(nèi)EGFP-LC3點(diǎn)狀聚集明顯增加，轉(zhuǎn)染RFP-GFP-LC3的PC12細(xì)胞內(nèi)GFP、RFP點(diǎn)狀聚集均顯著增加，而且RFP點(diǎn)狀聚集增加更為明顯；3）原代培養(yǎng)的大鼠中腦神經(jīng)元中，普拉克索作用后LC3熒光點(diǎn)狀聚集明顯增多；4）透射電鏡觀察到普拉克索及喹吡羅處理12 h后PC12細(xì)胞內(nèi)自噬小體形成明顯增多；5）特異性多巴胺 D2，D

8、3受體抑制劑存在時(shí)，普拉克索不能促使多巴胺能細(xì)胞中上述自噬相關(guān)蛋白水平改變。6）在上述研究使用的劑量范圍內(nèi)（普拉克索不高于100μM、喹吡羅不高于10μM），這些D2樣受體激動(dòng)劑作用24 h, PC12細(xì)胞活力并沒(méi)有明顯變化，也未發(fā)生明顯凋亡。上述結(jié)果充分表明，以普拉克索為代表的多巴胺D2樣受體激動(dòng)劑可以誘導(dǎo)并增加多巴胺細(xì)胞內(nèi)的自噬水平，且在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)多巴胺能細(xì)胞活力沒(méi)有明顯影響。
　　3.相關(guān)機(jī)制研究結(jié)果：普拉克索作用于

9、PC12細(xì)胞后引起：1）c-Fos蛋白表達(dá)隨時(shí)間依賴性增加；2）p-CaMKIV(Thr196)和p-CREB(S133)的磷酸化水平明顯增加；3）p-JNK(Thr183/Tyr185)和 p-c-Jun(S63)的磷酸化水平及 c-jun總蛋白水平?jīng)]有明顯變化；4）普拉克索和喹吡羅未能下調(diào)p-mTOR(S2248), p-p70S6K(Thr389)及p-ULK1(S757)位點(diǎn)的磷酸化水平及上調(diào)p-ULK1(S555)的磷酸化水平

10、；與經(jīng)典的饑餓誘導(dǎo)的自噬（使PC12細(xì)胞處于EBSS溶液中）相比，相反在30 min到1 h普拉克索能顯著上調(diào)p-mTOR(S2248)和p-p70S6K(Thr389)及p-ULK1(S757)的磷酸化水平；5）BECN1 mRNA水平隨普拉克索濃度增加而增加；免疫共沉淀（Co-IP）發(fā)現(xiàn)普拉克索及喹吡羅作用后Beclin1和PtdIns3K蛋白結(jié)合明顯增加；6）普拉克索促進(jìn)PC12細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子水平增加，去除細(xì)胞內(nèi)鈣離子后，普拉克

11、索無(wú)法使c-Fos、Beclin1和LC3-II蛋白水平增加；7）BECN1基因沉默后，普拉克索并不能使LC3-II增加；Beclin1蛋白過(guò)表達(dá)，LC3-II水平明顯增加；8）c-Fos基因沉默后，Beclin1和LC3-II均無(wú)明顯增加；而c-Fos過(guò)表達(dá)，Beclin1和LC3-II均明顯增加；9）染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）結(jié)果顯示c-Fos可與BECN1上游類似經(jīng)典的AP-1（5'-TGCCTCA-3）位點(diǎn)結(jié)合；10)熒光素酶

12、雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)普拉克索可使BECN1啟動(dòng)子活性增加，這個(gè)AP-1位點(diǎn)缺失突變后則無(wú)法增加。
　　4.普拉克索對(duì)易聚集蛋白的降解作用結(jié)果：1）普拉克索可促進(jìn)魚藤酮處理后正常及過(guò)表達(dá)WT、A53T和A30P-SNCA的PC12細(xì)胞內(nèi)α-synuclein蛋白的降解；2）腹腔注射普拉克索對(duì)正常及 A53T-SNCA小鼠黑質(zhì)及紋狀體內(nèi)自噬水平有增高趨勢(shì),且α-synuclein蛋白蓄積有一定程度的減少；3）普拉克索可促進(jìn)Htt-552-18