PPARγ配體Rosiglitazone預(yù)防胃癌的動物實驗及PPARγ2 Pro12Ala基因多態(tài)性與我國胃癌關(guān)系的研究.pdf

1、胃癌(gastriccancer,GC)是最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響著我國人民的健康?，F(xiàn)有治療方法如手術(shù)、放療、化療效果均不理想，根除幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)及抗氧化劑治療是否對降低或預(yù)防胃癌的發(fā)生具有真正價值還在進一步探討。我們前期研究發(fā)現(xiàn)特異性COX-2抑制劑Celecoxib可抑制N-甲基-N'-硝基-亞硝基胍(N-methyl-N-nitro-N'nitrosoguanidine，MNNG)誘

2、導(dǎo)的大鼠胃癌的發(fā)生，首次從體內(nèi)實驗的角度肯定了特異性COX-2抑制劑對胃癌的預(yù)防作用，為尋找胃癌預(yù)防的新靶點提供了線索。 近年來，過氧化物酶體增殖活化受體(peroxisomeproliferator-activatedreceptors，PPAR)與惡性腫瘤的關(guān)系受到人們的重視。作為Ⅱ型核激素受體超家族成員，PPARγ高表達于多種惡性腫瘤組織及腫瘤細胞株，PPARγ合成配體噻唑烷二酮類藥物(thiazolidinedione，

3、TZD)羅格列酮(rosiglitazone，RSG)和曲格列酮(troglitazone，TRG))等可抑制多種腫瘤細胞如胰腺癌、食管癌、肝癌及結(jié)腸癌細胞的增殖、誘導(dǎo)凋亡。PPARγ與胃癌的研究已取得一定進展，PPARγ高表達于胃癌及癌前病變組織，其表達強度與胃黏膜異型程度有關(guān)；人類胃癌細胞株MKN-7、MKN-28、MKN-45、AGS中亦有PPARγ的活化，體外實驗顯示PPARγ配體15d-PGJ2和ciglitazone呈劑量依

4、賴性抑制胃癌細胞的生長，誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡；體內(nèi)實驗進一步表明Rosiglitazone還可顯著抑制接種MKN-45的裸鼠移植瘤的生長，腫瘤體積明顯減小。 以上研究提示PPARγ與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，但現(xiàn)有研究多限于體外水平，體內(nèi)研究鮮有報道。為此，本研究以化學(xué)致癌劑MNNG誘導(dǎo)的大鼠腺胃癌動物模型為基礎(chǔ)，探討PPARγ配體Rosiglitazone對實驗性大鼠腺胃癌發(fā)生的影響，明確Rosiglitazone是否具有預(yù)防胃

5、癌的作用及其可能的機制。 由于PPARγ配體作用的發(fā)揮必需通過激活靶細胞的核受體PPARγ，再與視黃酸受體(retinoicxreceptors，RXR)形成二聚體后，結(jié)合靶基因啟動子區(qū)的過氧化物酶體增殖反應(yīng)元件(PPARresponseelements，PPRE)而發(fā)揮調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄的作用。因此，PPARγ基因多態(tài)性及受其調(diào)控的PPARγ受體表達水平是影響PPARγ配體發(fā)揮作用的重要因素。PPARγ2Pro12Ala基因多態(tài)性

6、是PPARγ2外顯子B第12密碼子的CCA-GCA的錯義突變，使得原來編碼的脯氨酸(Pro)變成了丙氨酸(Ala)，其與胃癌關(guān)系的研究是一個新興課題。為此，本研究還對我國胃癌人群和普通人群的PPARγ2基因位點多態(tài)性進行分析，探討PPARγ2Pro12Ala基因多態(tài)性與胃癌發(fā)生的關(guān)系。 第一部分Rosiglitazone預(yù)防胃癌的動物實驗及作用機理的研究 第1節(jié)Rosiglitazone對MNNG誘導(dǎo)的大鼠胃癌發(fā)生的影響

7、 目的：探討Rosiglitazone對化學(xué)致癌劑MNNG誘導(dǎo)的大鼠胃癌發(fā)生的影響。 方法：二級Wistar大鼠90只，5周齡，體重60-80克，雄性，隨機分為5組(A、B、C、D、E組)，A組10只，B-E組每組各20只。A組：自由飲用蒸餾水；B組：飲用含MNNG100μg/ml的蒸餾水；C-E組：除飲用含MNNG100μg/ml的蒸餾水外，還分別灌喂Rosiglitazone0.2mg/kg、0.8mg/kg、3.2

8、mg/kg，1次/日。實驗頭6周，B-E組每周一次用10％NaCl溶液1ml灌胃。以上處理連續(xù)10個月。處理因素結(jié)束后2個月乙醚麻醉處死動物，組織經(jīng)10％中性福爾馬林固定，HE染色，比較各組動物胃癌發(fā)生率的差異。 結(jié)果：①90只Wistar大鼠實驗頭7個月未見死亡，7個月后至實驗終點前死亡或發(fā)現(xiàn)異常及時處死共23只(26％)，其中B組11只，C組5只，D組4只，E組3只，余67只動物至研究終點。在上述23只動物中，22只存在胃或

9、小腸腫瘤。 ②A、B、C、D、E組動物胃癌的發(fā)生率分別為0％(0/10)、70％(14/20)、15％(3/20)、30％(6/20)和30％(6/20)，病理組織學(xué)證實為腺癌。與B組相比，C、D、E組動物腺胃癌的發(fā)生率均明顯低于B組動物(15％vs75％，P=0.001；30％vs70％，P=0.026；30％vs70％，P=0.026)，且腫瘤體積也比B組動物明顯減小(B-E組分別為50.4±30.5，0.4±0.2，1.6

10、±1.6，16.1±15.7mm3，P=0.004)。 結(jié)論：PPARγ配體Rosiglitazone能顯著降低MNNG誘導(dǎo)的大鼠腺胃癌發(fā)生率，提示Rosiglitazone具有預(yù)防胃癌的作用。 第2節(jié)Rosiglitazone預(yù)防MNNG誘導(dǎo)的大鼠腺胃癌形成機制的研究 目的：探討PPARγ配體Rosiglitazone預(yù)防胃癌發(fā)生的可能機制。 方法：研究標(biāo)本來源于第1節(jié)動物標(biāo)本：①乙醚麻醉處死動物后，及

11、時留取A組動物的胃組織及B-E組動物的胃腫瘤組織、未發(fā)生腫瘤的動物的胃組織，置液氮中，后置-80℃超低溫冰箱中保存；②采用Trizol法提取RNA；③逆轉(zhuǎn)錄-PCR法(reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)檢測上述動物標(biāo)本的PPARγ、PTEN、Akt、BAD、Caspase3、CyclinD、P27mRNA表達，比較上述指標(biāo)在各組動物中的差異。引物序列及反應(yīng)條件見正文。

12、 結(jié)果：①各組動物胃組織均有PPARγmRNA的表達，但B-E組的胃腫瘤組織中PPARγ的表達明顯高于A組，亦明顯高于相應(yīng)各組中未發(fā)生腫瘤的胃組織(P＜0.01)。 ②與A組相比，B組的胃癌組織中抑癌基因PTEN表達水平明顯下降，而Akt表達增加(P＜0.001)；C、D、E組動物的胃癌組織PTEN表達量有所增加，Akt表達明顯降低，與B組相比具有顯著性差異(P＜0.05)。 ③與A組相比，B組的胃癌組織中BAD及

13、Caspase3mRNA表達水平明顯下降(P＜0.001)；C、D、E組動物的胃癌組織中BAD及Caspase3mRNA表達水平明顯增加，與B組相比具有顯著性差異(P＜0.05)。A組胃組織及B-E組動物的胃腫瘤組織、未發(fā)生腫瘤的動物的胃組織中，CyclinD及P27mRNA表達均未見明顯差異。 結(jié)論：PPARγ配體Rosiglitazone預(yù)防胃癌發(fā)生的作用可能與激活抑癌基因PTEN、抑制Akt活化，以及促進凋亡誘導(dǎo)蛋白BAD

14、及凋亡蛋白質(zhì)酶Caspase3的表達有關(guān)。 第二部分PPARγ2Pro12Ala基因多態(tài)性與我國胃癌關(guān)系的研究 目的：研究PPARγ2Pro12Ala基因多態(tài)性在我國普通人群和胃癌患者中的分布，探討我國漢人PPARγ2Pro12Ala基因多態(tài)性、幽門螺桿菌(Hp)感染與胃癌的關(guān)系。 方法：性別及年齡匹配的漢族廣東籍胃癌患者、健康志愿者各104例，采用限制性片段長度多態(tài)性(PCR-restrictionfragme

15、ntlengthpolymorphism，PCR-RFLP)分析PPARγ2Pro12Ala基因多態(tài)性，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清抗Hp-IgG抗體。 結(jié)果：①胃癌人群Hp感染率明顯高于對照人群(81.7％vs59.6％，χ2=12.27，P＜0.01；OR=3.0，95％CI=1.6-5.7)。 ②對照人群PPARγ2基因Pro12Ala多態(tài)性位點的基因型CC(Pro12Pro)、CG(Pro12Ala)、G

16、G(Ala12Ala)的頻率分別為91.3％、8.7％、0，C等位基因頻率和G等位基因頻率為95.7％、4.3％。 ③胃癌患者中攜帶有PPARγ2G等位基因者的比率明顯高于對照人群(19.2％vs8.7％，P＜0.05；OR=2.5，95％CI=1.1-5.8)，PPARγ2G等位基因攜帶者感染Hp后發(fā)生胃癌的危險性顯著增加(OR=12.8，95％CI=3.2-50.5)。 結(jié)論：PPARγ2G等位基因與我國漢族人群胃癌