納米金和納米三氧化二鐵的細(xì)胞毒性及其在癌細(xì)胞靶向治療和成像中的研究與應(yīng)用.pdf

1、納米材料是指幾何尺寸小于100nm,并具有特殊性能的材料.它所特有的表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)以及宏觀量子隧道效應(yīng)使之呈現(xiàn)出許多與同質(zhì)單分子或大塊物體不同的光學(xué)性質(zhì)、催化能力和表面化學(xué)性質(zhì),因而納米材料在生物、醫(yī)學(xué)等許多領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用前景。然而,這些獨(dú)特的性能也使得納米材料能夠與生物體之間發(fā)生一些特殊反應(yīng)而產(chǎn)生潛在的毒性,可能會(huì)給人類的健康帶來危害.因此,納米材料的生物安全性問題已經(jīng)成為現(xiàn)階段材料學(xué)和生物學(xué)共同關(guān)注和研究的

2、熱點(diǎn)。納米金由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和光學(xué)特性而被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞標(biāo)記和成像、基因檢測(cè)以及藥物輸送等.同樣,具有良好的表面化學(xué)性質(zhì)和超順磁性的納米三氧化二鐵也已經(jīng)被成功用于催化、分離、核磁成像和腫瘤的磁療.但是,近年來的一些研究卻表明這兩種納米粒子具有尺寸、形貌依賴的細(xì)胞毒性,并且由于表面修飾基團(tuán)和自身的催化活性會(huì)引起活性氧的過量產(chǎn)生。盡管如此,它們與生物體特別是細(xì)胞之間具體的作用機(jī)制尚不明確,關(guān)于這兩種納米粒子是如何影響和調(diào)控細(xì)胞功能的研究還比

3、較少。因此,研究它們與細(xì)胞內(nèi)小分子和蛋白質(zhì)的反應(yīng)機(jī)理,對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)和活性氧產(chǎn)生的影響,以及活性氧對(duì)細(xì)胞凋亡和腫瘤生成的調(diào)控是十分必要的。這對(duì)進(jìn)一步闡明納米金和納米三氧化二鐵的細(xì)胞毒性機(jī)理以及活性氧在相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的作用機(jī)制具有非同尋常的科學(xué)意義.在此基礎(chǔ)上,一方面我們可以通過合理的修飾,有效的降低上述兩種納米粒子的細(xì)胞毒性,再利用各自的特性使之更好的應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究。另一方面,我們也可以反向利用其細(xì)胞毒性,作為一種新型

4、的治療癌癥的方法用于誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡.通過將這兩種納米粒子進(jìn)行組裝,并在表面修飾結(jié)合一些靶向序列或熒光基團(tuán)構(gòu)建多功能的復(fù)合納米材料,使其同時(shí)具有靶向、治療和成像功能,在癌癥的診斷和治療方面必將具有重要的應(yīng)用前景。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、偶{米金(AuNPs)對(duì)人正常肝細(xì)胞HL7702細(xì)胞毒性的研究。通過研究AuNPs與谷胱甘肽(GSH)的反應(yīng)機(jī)理,闡明了AuNPs對(duì)肝細(xì)胞HL7702內(nèi)氧化還原平衡的影響及其激活的線粒體通路中相關(guān)

5、凋亡事件的發(fā)生順序.濃度為50 nM的8 nm AuNPs處理HL7702細(xì)胞后,首先引起細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的GSH的大量減少,在12小時(shí)左右就對(duì)線粒體跨膜電位(ΔΨm)造成影響使其有所下降,開始啟動(dòng)了細(xì)胞的凋亡.而大約在48小時(shí)之后,線粒體內(nèi)GSH的含量才發(fā)生明顯減少,并造成線粒體內(nèi)過氧化氫(H2O2)的含量也隨之逐漸增加.升高的H2O2引起線粒體凋亡通路中促凋亡蛋白Bax的轉(zhuǎn)運(yùn),細(xì)胞色素c的釋放以及下游凋亡蛋白caspase3的激活,HL77

6、02細(xì)胞的凋亡進(jìn)一步加劇。
　?、萍{米三氧化二鐵(γ-Fe2O3)細(xì)胞毒性的反向應(yīng)用。設(shè)計(jì)構(gòu)建一種生物功能化的Au-Fe2O3復(fù)合納米粒子用于靶向誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡并進(jìn)行實(shí)時(shí)成像.所合成的Au-Fe2O3納米粒子兼具了Au和γ-Fe2O3的優(yōu)點(diǎn),具有良好的熒光猝滅性質(zhì)和催化活性。通過在Au表面修飾能夠靶向癌細(xì)胞整合素αⅤβ3受體的序列(RGD)和異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的capsase-3特異性識(shí)別序列DEVD,得到的RGD/F

7、ITC–DEVD–Au-Fe2O3復(fù)合納米粒子可以選擇性的識(shí)別肝癌細(xì)胞HepG2,催化這一細(xì)胞內(nèi)羥基自由基(OH)的生成,并且能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)由?OH誘導(dǎo)的caspase-3依賴的細(xì)胞凋亡.此外,它的催化活性由于Au-Fe2O3的表面極化作用也比單獨(dú)的γ-Fe2O3有所提高.這種生物功能化的Au-Fe2O3復(fù)合納米粒子同時(shí)具有靶向、治療和成像功能,因此對(duì)癌癥的治療具有十分重要的意義。
　?、浅蹶庪x子(O2)和過氧化氫(H2O2)兩種

8、活性氧對(duì)腫瘤生成的調(diào)控作用。利用本實(shí)驗(yàn)室合成的兩種熒光探針DBZTC和NFDS-1,檢測(cè)肝癌細(xì)胞HepG2的線粒體內(nèi)兩種活性氧O2和H2O2的含量,發(fā)現(xiàn)由于線粒體ND6基因突變?cè)斐善浜棵黠@升高,分別為0.63±0.07μM和1.13±0.05μM。通過構(gòu)建攜帶完整ND6基因片段的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ND6并轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,檢測(cè)這種未發(fā)生突變的重組HepG2細(xì)胞內(nèi)兩種活性氧含量要低很多,進(jìn)一步驗(yàn)證了ND6基因突變是引起