祛邪膠囊治療結(jié)直腸癌的機(jī)制研究及用藥方式初探.pdf

1、背景:祛邪膠囊是從古方“陰陽(yáng)攻積丸”化裁而來(lái)的制劑，臨床應(yīng)用十余年，前期的研究中發(fā)現(xiàn)祛邪膠囊可減少晚期腸癌病死率，延長(zhǎng)生存期、中位生存期，提高生存質(zhì)量，可以減少Ⅱ～Ⅲ期結(jié)腸直腸癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。但是對(duì)于其作用的分子機(jī)制研究空白，對(duì)于李中梓的用藥方式的合理性尚未進(jìn)行探討。本研究立足于前期的臨床研究結(jié)果，探討祛邪膠囊對(duì)于晚期腸癌的可能作用機(jī)制及合理用藥方式。
　　方法:本研究利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，APA、MTS法檢測(cè)祛邪膠囊含藥血清對(duì)腸癌HC

2、T-116及另外幾種組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞增殖抑制率，檢測(cè)祛邪膠囊與祛邪膠囊去掉有毒成分巴豆、豬牙皂以及祛邪膠囊與四君子湯合方單方對(duì)腸癌細(xì)胞HCT-116細(xì)胞的增殖抑制率;流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)AnexinⅤ-FITC+/IP雙染法檢測(cè)祛邪膠囊與四君子湯以及合方的早期凋亡率與中晚期凋亡率;Westernbloting檢測(cè)凋亡與自噬的相關(guān)蛋白Caspase-3和LC3表達(dá)的改變;利用CT-26荷瘤Balb/c小鼠模型評(píng)價(jià)祛邪膠囊拆方及與四君子湯合方

3、的生存期、抑瘤率、體重、瘤重，以及祛邪膠囊激光共聚焦顯微鏡下觀察腸癌預(yù)后相關(guān)蛋白PI3K、PTEN、KRAS表達(dá)。用EILISA法和流式細(xì)胞小球微陣列術(shù)法檢測(cè)抗腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-2，觀察Th1/Th2平衡的變化，驗(yàn)證臨床使用的低毒祛邪膠囊優(yōu)勢(shì)、機(jī)理及其溫陽(yáng)法的免疫學(xué)表達(dá)特點(diǎn)。
　　結(jié)果:本研究通過(guò)10％含藥血清實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)祛邪膠囊在體外對(duì)人腸癌HCT-116細(xì)胞抑制率(71.28±5.22)與其他組織來(lái)源的腫

4、瘤細(xì)胞乳腺癌MDA-MBA-231(22.94±2.87)，肝癌Bel-7402(26.74±3.34)，宮頸癌Hela(45.80±4.21)，相比具有顯著差異(P＜0.05)，且對(duì)健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)抑制率較低（-10.38±1.13）(P＜0.01)。與其他時(shí)間點(diǎn)(6h、12h、48h)和濃度相比(5％、20％)相比祛邪膠囊抑制腸癌HCT-116細(xì)胞的最佳時(shí)間濃度結(jié)合點(diǎn)是10％含藥血清濃度作用24h。與祛邪膠囊全方組

5、相比，祛邪膠囊去關(guān)鍵有毒成分巴豆和豬牙皂組后體外細(xì)胞抑制作用與全方組相比降低，分別為:祛邪膠囊去巴豆(63.29±4.24)、祛邪膠囊去巴豆豬牙皂(61.34±2.34)(P＜0.05)。祛邪膠囊與扶正方劑四君子湯合用可削弱外抑瘤作用(20.01±3.83)(P＜0.05)。AnexinⅤ-FITC+/IP雙染法檢測(cè)祛邪膠囊組早期凋亡(13.3±3.21)、中晚期凋亡率(35.38±5.23)，Western Bloting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)祛邪

6、膠囊組凋亡相關(guān)蛋白caspase-3增高、祛邪膠囊+四君子湯組LC3與caspase-3表達(dá)均增高。加入自噬抑制劑3-MA后四君子湯+祛邪膠囊組（34.21±3.92）細(xì)胞抑制率顯著增加(P＜0.05)。
　　通過(guò)體內(nèi)急毒實(shí)驗(yàn)證明祛邪膠囊最大給藥量為20g/kg。
　　通過(guò)建立腸癌CT-26細(xì)胞種植babl/c小鼠模型發(fā)現(xiàn)祛邪膠囊組腫瘤與對(duì)照組相比瘤重減小，但小鼠生存率下降，體重下降，Th1/Th2升高，各組抑瘤率和生存率分

7、別為:祛邪膠囊組(16.92％±1.53、21.34％±1.50)、祛邪膠囊去巴豆(-8.72％±3.87、39.32％±3.27)、祛邪膠囊去巴豆豬牙皂(21.26％±3.21、54.21％±9.85)、祛邪膠囊與四君子湯同服(19.14％±7.84、58.51％±4.92)、祛邪膠囊與四君子湯交替服(21.23％±4.90、72.98％±5.27)、5-FU(22.44％±4.23、60.29％±3.32)、陰性對(duì)照(0、49.28

8、％±3.29)。祛邪膠囊去巴豆豬牙皂組生存率高于祛邪膠囊組，但Th1/Th2下降(P＜0.05)。祛邪膠囊+四君子湯組祛邪膠囊與四君子湯交替服用組小鼠與對(duì)照組比生存率增高，體重增加，小鼠Th1/Th2升高(P＜0.01)，祛邪膠囊與四君子湯交替服用組小鼠生存率與抑瘤率均優(yōu)于祛邪膠囊+四君子湯組(P＜0.05)，祛邪膠囊組、祛邪膠囊+四君子湯組與對(duì)照組IL-2下降(P＜0.05)，祛邪膠囊與四君子湯交替服組與對(duì)照組相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

9、。激光共聚焦顯微鏡下觀察可見(jiàn)祛邪膠囊組，祛邪膠囊去巴豆組、祛邪膠囊去巴豆豬牙皂瘤體LC3、PI3K、PTEN比陰性、陽(yáng)性對(duì)照組有不同程度表達(dá)增高，祛邪膠囊各拆方組KRAS比陰性、陽(yáng)性對(duì)照組表達(dá)略有降低。經(jīng)過(guò)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果改良的方案:祛邪膠囊（低毒）生存率優(yōu)于祛邪膠囊與四君子湯交替服組(P＜0.05)。與交替組相比，祛邪膠囊組血清可見(jiàn)IFN-γ表達(dá)升高(P＜0.05)。Th1/Th2升高及IL-6下降相關(guān)。在激光共聚焦顯微鏡下可以觀察到祛邪

10、膠囊與四君子湯交替組和祛邪膠囊（低毒）組LC3，KRAS，PTEN表達(dá)降低。祛邪膠囊與四君子湯交替服組可見(jiàn)PI3K表達(dá)升高。祛邪膠囊與腸癌扶正解毒自擬方相比IFN-γ、IL-6表達(dá)增高。
　　結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)祛邪膠囊含藥血清具有體外對(duì)腸癌細(xì)胞HCT-116的顯著抑制作用，優(yōu)于其他組織來(lái)源三種腫瘤細(xì)胞，并具有高效低毒(PBMC)。我們發(fā)現(xiàn)祛邪膠囊含藥血清在體外可通過(guò)凋亡通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。而祛邪膠囊與四君子湯同用可以拮抗體外抗腫瘤

11、作用，可能與自噬通路相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)祛邪膠囊去掉關(guān)鍵有毒成分巴豆和豬牙皂后的體外抑制作用減弱。祛邪膠囊荷瘤小鼠生存期較短，體重下降，Th1/Th2平衡向Th1強(qiáng)烈漂移，IL-2表達(dá)下降。而祛邪膠囊與四君子湯合用組則生存期延長(zhǎng)，相比與四君子湯合用，祛邪膠囊與四君子湯交替服用取得了更好的生存率和抑瘤率，可能與獲得了相對(duì)合理的Th1/Th2免疫平衡有關(guān)。祛邪膠囊（低毒）與其余各組相比生存率提升，可能與IL-6下調(diào)和IFN-γ上調(diào)，Th1/Th

12、2平衡向Th1漂移。在激光共聚焦顯微鏡下可以觀察到祛邪膠囊與四君子湯交替組和祛邪膠囊（低毒）組LC3，KRAS，PTEN表達(dá)降低。祛邪膠囊與四君子湯交替服組可見(jiàn)PI3K表達(dá)升高。祛邪膠囊與清熱解毒方劑“腸癌清熱解毒自擬方”相比IL-6、IFN-γ表達(dá)俱有顯著提升。通過(guò)本研究間接驗(yàn)證了五百年前李中梓用藥醫(yī)囑。同時(shí)發(fā)現(xiàn)祛邪膠囊與四君子湯合用可以在小鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)T輔助細(xì)胞功能，改善Th1/Th2免疫平衡。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研發(fā)的祛邪膠囊（低毒）取得了較