同型半胱氨酸與動脈粥樣硬化易損斑塊的關聯機制及他汀類藥物干預作用.pdf

1、高同型半胱氨酸(Hcy)血癥是動脈粥樣硬化(AS)和動、靜脈血栓形成的獨立危險因子,可以誘發(fā)心腦血管疾病的發(fā)生,但至今缺乏理想有效的治療措施.目前國內外尚無關于高Hcy血癥與AS易損斑塊的關聯機制及他汀類藥物干預作用的系統(tǒng)研究. 本研究擬建立ApoE基因缺陷高Hcy血癥AS動物模型,利用他汀類或/和葉酸、維生素B<,12>干預性治療,觀察血漿中Hcy、血脂、炎癥因子水平以及斑塊大小、纖維帽、膠原比例、炎癥浸潤程度的變化;并在離體水平觀察

2、不同Hcy刺激水平對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和大鼠血管平滑肌細胞(VSMCs)的增殖和凋亡影響及他汀類藥物對其的干預效應.上述研究結果將對伴有高Hcy血癥的高危心血管病患者的防治提供更有臨床價值的信息. [方法] 1、2﹪(wt/vol)L-蛋氨酸負荷誘導.ApoE基因缺陷小鼠的高Hcy血癥的.AS易損斑塊模型,測定血清Hcy、血脂變化,并通過斑塊HE,elastica-Van Gieson,膠原染色及anti-M

3、AC3單克隆抗體標記來檢測斑塊大小、纖維帽厚度、膠原比例和炎癥浸潤程度的變化; 2、采用免疫組織化學和原位雜交方法檢測小鼠血管壁中NF-κB的表達和活化水平;免疫組化法檢測血管壁中PCNA、VCAM-1、ICAM-1和Caspase3表達情況;末端脫氧核苷酰轉移酶原位標記(TUNEL)法檢測小鼠主動脈斑塊中的細胞凋亡指數(AI);并通過酶聯免疫吸附實驗(EUSA)法檢測小鼠血漿中MCP-1、MMP-9、MMP-2、TIMP-1

4、和丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平,觀察Hcy對基因敲除小鼠體內炎癥、氧化應激反應程度和細胞增殖、凋亡的影響以及阿托伐他汀或/和葉酸、維生素B<,12>的干預作用. 3、原代培養(yǎng)HUVEC細胞,予以Hcy或/和辛伐他汀處理24h后,用Annexin V染色加流式細胞術、DNA梯度法、TUNEL以及電鏡了解細胞凋亡狀態(tài);RT-PCR和蛋白質印跡技術檢測caspase3、c-IAP1和c-IAP2的mRNA和蛋白質水平

5、.同時予以Hcy、辛伐他汀、PKC抑制劑處理HUVEC不同時間點后,用TransAM<'TM>系統(tǒng)和凝膠電泳遷移率實驗(EMSA)法檢測NF-кB P65轉錄因子的活性,蛋白質印跡技術分析相關蛋白的表達. 4、采用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)大鼠胸主動脈VSMCs,用不同濃度的Hcy刺激大鼠VSMCs,在不同的時間點以四甲基偶氮唑鹽法檢測Hcy對VSMCs的活性細胞數量及增殖的影響;以5溴-2脫氧尿苷(BrdU)法檢測Hcy對大鼠VSM

6、Cs DNA合成的作用;流式細胞儀觀察細胞周期的變化；ELISA法測定膠原的含量.同時RT-PCR法檢測細胞中c-myc和p27<'kipl>mRNA含量,蛋白印跡法檢測P27<'kipl>,cyclin D1,cyclinE、cyclin A和PCNA蛋白質表達. [結果]1、高蛋氨酸負荷可誘導ApoE基因缺陷小鼠主動脈血管壁易損斑塊產生,且隨負荷提高和時間延長程度加重;凋亡細胞在脂核區(qū)大量積聚;內皮細胞水腫變性;SMCs由收

7、縮型向合成型轉變,胞漿疏松,水腫變性,內質網擴張,胞漿內空泡增多以及肌絲溶解;并可見核固縮的凋亡SMCs. 2、病變小鼠體內主動脈組織NF-кB 活化,血清和心肌組織MDA、血清MCP-1、MMP-9、MMP-2水平及主動脈斑塊內Caspase 3、PCNA、VCAM-1、ICAM-1水平和AI較對照組顯著升高,血清和心肌組織SOD和血清TIMP-1水平則顯著下降;阿托伐他汀干預后,NF-кB活化程度降低,血清和心肌組織MDA、

8、血清MCP-1、MMP-9、MMP-2水平及主動脈斑塊內Caspase 3、PCNA、VCAM-1、ICAM-1水平和AI較對照組顯著下降,血清和心肌組織SOD水平、血清TIMP-1水平顯著升高,炎癥和氧化應激程度改善.而葉酸、維生素B<,12>無此作用. 3、0.5mmol/l和3mmol/L的Hcy均導致HUVEC凋亡,隨濃度增高而加重;并伴有caspase3活化增強,c-IAPl和c-IAP2的mRNA和蛋白質水平降低,辛

9、伐他汀可以上調c-IAPl和c-IAP2的表達. 4.在高濃度Hcy(3mmol/L)刺激下,HUVEC的NF-K B的活化高峰出現在作用30'和6h時;且伴有IKBα短暫快速的磷酸化及IKKα、IKKβ和PKC蛋白水平升高(P(0.05);MMP2、MMP-9及IL-1β顯著增加.而辛伐他汀和PKC抑制劑能顯著抑制NF-KB活化及其繼發(fā)的MMP-2、MMP-9及IL-1β升高. 5、0.025-0.05mmol/L的H

10、cy刺激VSMCs 12-48h后細胞增殖明顯(P<0.05),增殖細胞S期的百分含量較對照組和Hcy其它濃度組明顯增加;隨著Hcy濃度的升高,大鼠VSMCs合成DNA開始下降,至5mmol/L濃度時合成最低.隨著Hcy濃度的升高,細胞的I型和Ⅳ型膠原分泌呈現劑量依賴性的增高模式;Ⅲ型膠原有輕度的升高,無統(tǒng)計學上意義;高濃度的Hcy會減少VI型膠原的分泌,并呈劑量依賴性. 6、低濃度(0.05mmol/L)Hcy可誘導大鼠VSM

11、Cs c-myc mRNA和蛋白質的表達增加,P27<'Kipl>mRNA和蛋白水平快速下調,并促進cyclin D1、E、A和PCNA蛋白表達增加.經10umol/L辛伐他汀作用24h后,P27<'kipl>表達與對照組相比明顯上調,并顯著抑制了c-myc、 cyclin D1、E、A和PCNA的表達. [結論] 1.高蛋氨酸飲食可誘導apoE基因缺陷小鼠出現高:Hcy血癥,從而生成AS易損斑塊,其NF-kB的活化程度

12、與斑塊的嚴重程度密切相關;氧化應激可直接導致NF-KB的活化,引起炎癥因子表達;斑塊內SMCs增生與凋亡現象并存.阿托伐他汀可以顯著增加小鼠易損斑塊的穩(wěn)定性. 2.Hcy誘導HUVEC凋亡,此種作用可能涉及caspase3相關途徑.辛伐他汀可促進c-IAP系統(tǒng)的表達,從而部分拈抗Hcy的作用. 3.Hcv能誘導HUVEC NF-κB系統(tǒng)活化,引起炎癥因子的表達與釋放,這些生物學效應是通過PKC-NF-κ B信號通路來實現