低氧預(yù)處理誘導(dǎo)的HIF-1α可促進(jìn)缺血再灌注損傷肝臟糖代謝并保護(hù)線粒體的研究.pdf

1、在肝移植手術(shù)過程中，從供肝的切取、修整、直到移植肝臟血液再通，肝臟勢必會(huì)經(jīng)歷一系列的缺血再灌注損傷。學(xué)者們先前的研究提示，低氧預(yù)處理可給予大腦組織保護(hù)。隨后的研究也顯示這一內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制同樣出現(xiàn)在肝臟和腎臟組織中。在腫瘤細(xì)胞中，低氧誘導(dǎo)因子-1α在低氧條件下起了非常重要的作用，低氧誘導(dǎo)因子-1α是重要的轉(zhuǎn)錄因子來介導(dǎo)細(xì)胞低氧反應(yīng)。為了減少在需氧代謝中活性氧對細(xì)胞DNA的損傷，由低氧誘導(dǎo)因子-1α調(diào)整介導(dǎo)的糖酵解轉(zhuǎn)錄可使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)

2、境。
　　學(xué)者們先前的研究發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)因子-1α可以減輕大鼠肝移植模型中的缺血再灌注損傷的發(fā)生。研究顯示低氧預(yù)處理可充分激活B淋巴細(xì)胞-2(Bcl-2)信號(hào)通路，從而上調(diào)Bcl-2蛋白，Bcl-2蛋白作為一種可以抑制凋亡的調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)整線粒體的結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)凋亡的發(fā)生。其他的研究發(fā)現(xiàn):低氧誘導(dǎo)因子-1α作為一個(gè)主要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)糖酵解和腫瘤細(xì)胞的糖代謝。低氧誘導(dǎo)因子-1α對糖代謝相關(guān)酶以及腫瘤細(xì)胞在有氧和低氧環(huán)境下的乳酸化合成也

3、有影響。己糖激酶(HK)通過產(chǎn)生果糖-6-磷酸來影響葡萄糖的變化，其可在糖酵解過程中，通過磷酸戊糖途徑進(jìn)入糖酵解來產(chǎn)生能量(PPP)，期間產(chǎn)生的NADPH和合成的中間體轉(zhuǎn)換為糖原進(jìn)行儲(chǔ)存，而HK-2在促進(jìn)合成代謝途徑方面起關(guān)鍵得作用，且在癌癥中高表達(dá)。
　　本實(shí)驗(yàn)，我們通過低氧預(yù)處理來促進(jìn)大鼠肝臟組織低氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)，并且檢測糖代謝的變化，同時(shí)檢測NF-κB和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ErK)通路.意在表明低氧誘導(dǎo)因子-1α通過

4、促進(jìn)己糖激酶2(HK-2)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(Glut-1)表達(dá)從而減輕肝臟炎癥及原位肝移植后的缺血再灌注損傷。
　　第一部分 低氧預(yù)適應(yīng)處理對肝移植大鼠肝細(xì)胞HIF-1α表達(dá)的影響
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)對大鼠行低氧預(yù)適應(yīng)(Hypoxia preconditioning HP)處理，隨后進(jìn)行自體原位肝移植，探討低氧預(yù)適應(yīng)肝移植大鼠術(shù)后低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia-inducible Factor-1α，HIF-

5、1α)表達(dá)情況。
　　方法：
　　1.清潔近交系Sprague Dawley純系雌性大鼠被隨機(jī)分為3組:低氧預(yù)處理自體原位肝移植組（HP組n=36）:供體術(shù)前行低氧預(yù)處理（氮氧混合氣體，流量5 L/min，含8％氧氣，共處理90分鐘），8小時(shí)后行大鼠自體肝移植;大鼠自體肝移植組（AT組n=36）:大鼠行自體原位肝移植;正常大鼠對照組(Ctrl組n=16)。
　　2.各組大鼠切取肝中葉，用RT-PCR技術(shù)檢測肝臟組織HI

6、F-1α mRNA表達(dá)的變化結(jié)果，Western blot檢測HIF-1α蛋白表達(dá)變化結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　1.HIF-1α mRNA表達(dá)結(jié)果:
　　為了檢驗(yàn)低氧欲處理是否可以增加大鼠肝臟組織低氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)，大鼠在低氧環(huán)境中接受90分鐘低氧預(yù)處理。治療后12小時(shí)，肝組織中低氧誘導(dǎo)因子-1α顯著增加(HP vs.Ctrl，P＜0.001)。相比于對照組，在術(shù)后12小時(shí)，肝組織中低氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)仍持續(xù)增

7、高(HP vs.AT, P＜0.001)。同時(shí)，在AT組，我們觀測到低氧誘導(dǎo)因子-1α也會(huì)增高，只是其增高水平不及HP組(ATvs.Ctrl，P=0.0597)。
　　2.HIF-1α蛋白表達(dá)結(jié)果:
　　在蛋白水平，術(shù)后24小時(shí)HP組HIF-1α在肝組織的表達(dá)較AT組和Ctrl組高。
　　結(jié)論：
　　經(jīng)過低氧預(yù)適應(yīng)處理大鼠自體肝移植術(shù)后，大鼠肝臟組織HIF-1α mRNA和HIF-1α蛋白表達(dá)均增多。
　　

8、第二部分 低氧誘導(dǎo)因子-1α促進(jìn)缺血再灌注肝臟糖代謝保護(hù)線粒體的研究
　　目的：
　　該實(shí)驗(yàn)隊(duì)大鼠自體原位肝移植模型上進(jìn)行，檢測到低氧預(yù)處理大鼠HIF-1αmRNA和HIF-1α蛋白表達(dá)增多這一結(jié)論基礎(chǔ)上。從而繼續(xù)探討低氧預(yù)處理是否對缺血再灌注肝臟糖代謝有影響及肝細(xì)胞線粒體是否有保護(hù)作用。
　　方法：
　　1.清潔近交系Sprague Dawley純系雌性大鼠被隨機(jī)分為3組:低氧預(yù)處理自體原位肝移植組（HP組n=

9、36）:供體術(shù)前行低氧預(yù)處理（氮氧混合氣體，流量5 L/min，含8％氧氣，共處理90分鐘），8小時(shí)后行大鼠自體肝移植;大鼠自體肝移植組（AT組n=36）:大鼠行自體原位肝移植;正常大鼠對照組(Ctrl組n=16)。
　　2.自體肝移植大鼠術(shù)后不同時(shí)間段指標(biāo)及形態(tài)學(xué)變化的比較。術(shù)后三組大鼠分別切取肝右葉，通過顯微鏡、電鏡觀察三組肝細(xì)胞組織學(xué)改變及肝細(xì)胞線粒體損傷情況;抽取尾靜脈血檢測肝功能指標(biāo)變化，檢測血清中的腫瘤壞死因子-α(T

10、NF-α)和白介素-6（IL-6）;RT-PCR技術(shù)檢測肝臟組織葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(Glut-1)mRNA、己糖激酶-2（Hexokinase-2 HK-2）mRNA、乳酸脫氫酶(Lactatedehydrogenase LDH)及丙酮酸脫氫酶激酶（PDK-1）表達(dá)的變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.低氧預(yù)處理促使NF-κB和ErK的表達(dá)
　　自體原位肝移植術(shù)后，我們觀察到術(shù)后24小時(shí)，HP組在大鼠肝組織中，NF-κB(

11、HP vs.AT,P=0.0078)磷酸化和ErK(HP vs.AT,P=0.0044)磷酸化均較AT組顯著增加。
　　2.低氧預(yù)處理后，隨著低氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)，肝細(xì)胞中糖代謝隨之增加
　　在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到術(shù)后肝組織中Glut-1 mRNA水平增高(HP vs.AT,12hand24h，P＜0.001)。HK-2 mRNA水平也增高(HP vs.AT,24 h，P=0.004)。術(shù)后24小時(shí)乳酸脫氫酶(LDH) m

12、RNA水平顯著增高(HP vs.AT,24 h，P=0.003;48 h，P=0.031)。 HP組術(shù)后丙酮酸脫氫酶激酶(PDK-1)術(shù)后顯著增高(HP vs.AT,24 h，P=0.007;48 h，P=0.001)。術(shù)后24小時(shí)HP組肝組織裂解液Glut-1表達(dá)明顯高于AT組(HP vs.AT,P=0.0476)，HK-2的表達(dá)也明顯增高(HP vs.AT,P=0.0373)。
　　3.低氧預(yù)處理保護(hù)肝臟、減輕肝臟缺血再灌注損

13、傷
　　我們通過透射電鏡觀察肝細(xì)胞線粒體形態(tài)學(xué)變化(46000X)。HP組較AT線粒體形態(tài)上更少腫脹。電鏡下，我們可以看到嵴斷裂，但仍有少部分排列尚好。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)尚存。而AT組，線粒體顯現(xiàn)出不同大小，有些甚至明顯松解，發(fā)生空泡變性，可見嵴的減少，因被不同程度的破壞或者消失。我們觀察線粒體復(fù)合體，發(fā)現(xiàn)在AT組復(fù)合體1由于被破壞而低表達(dá);HP組和對照組相比，復(fù)合體1沒有明顯變化。通過TUNEL分析我們發(fā)現(xiàn)AT組在術(shù)后12小時(shí)肝臟組織發(fā)

14、現(xiàn)更多的凋亡。在肝細(xì)胞裂解液中，術(shù)后12小時(shí)Caspase-3AT組明顯高于HP組(HPvs.AT,P=0.0119)，同樣PARP在AT組也明顯增高(HP vs.AT,P=0.0134)。
　　4.大鼠模型中肝臟功能及炎癥的變化
　　為了證實(shí)缺氧欲處理是否可保護(hù)肝臟免受缺血再灌注損傷，我們檢測了大鼠血清中ALT和AST。HP組血清中ALT和AST輕度升高，AT組，ALT和AST升高明顯，兩組比較，具有顯著性差異(ALT:

15、HP vs.AT,6 h，P=0.003;12 h，P=0.001;AST: HP vs.AT,12 h，P=0.002;24 h，P=0.006)。我們檢測血清中的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)，發(fā)現(xiàn)HP組由于更低的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)表達(dá)而表現(xiàn)出更輕的炎癥反應(yīng)(TNF-α:HP vs.AT,48 h，P=0.0008; IL-6: HP vs.AT,48 h，P=0.0213