高強(qiáng)度聚焦超聲制備DC瘤苗及其治療作用和促腫瘤凋亡作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：①建立體外大量擴(kuò)增小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell DC)的方法；②應(yīng)用高強(qiáng)度聚焦超聲(high intensity focused ultrasound HIFU)輻照腫瘤細(xì)胞獲取腫瘤抗原并致敏DC，制備DC腫瘤疫苗：觀察此方法制備的DC瘤苗對(duì)己接種腫瘤細(xì)胞小鼠的主動(dòng)治療作用。③觀察腫瘤細(xì)胞的凋亡情況，并初步探討其治療機(jī)理，從而為研究臨床腫瘤的治療尋求新的途徑，也為腫瘤疫苗的研制開(kāi)拓新的思路，同時(shí)為 HIFU開(kāi)辟新的

2、應(yīng)用領(lǐng)域。 方法：①應(yīng)用 10ng/ml 的白介素-4 ( interleukin，IL-4) 和 10ng/ml 的粒細(xì)胞- 巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓細(xì)胞，光鏡及電子顯微鏡觀察DC發(fā)育過(guò)程中形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) DC 表面分子 CD80、CD86、H-2Kd 及 I-Ad 的表達(dá)情況；②應(yīng)用不

3、同劑量的HIFU 輻照體外培養(yǎng)的CT-26腫瘤細(xì)胞后，用臺(tái)盼蘭染色、MTT法測(cè)定活細(xì)胞數(shù)，觀察腫瘤細(xì)胞存活率，并觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，從而找出致制備腫瘤抗原的工作劑量。③用劑量(1000W/cm<'2>×30s) 的HIFU輻照體外培養(yǎng)的CT-26腫瘤細(xì)胞后，制備出腫瘤抗原并致敏 DC，制備DC瘤苗。④。DC 瘤苗的治療作用的觀察研究：設(shè)立 HIFU輻照組(A 組)，反復(fù)凍融組(B組)，單純DC組(C組)，以及陰性對(duì)照組(D組)。正常

4、BALB/c 小鼠皮下接種活的CT-26結(jié)腸癌細(xì)胞(5×10<'5>/只)，7天后分別經(jīng)皮下注射HIFU輻照制備的DC瘤苗，反復(fù)凍融制備的DC瘤苗，單純的DC細(xì)胞，以及等量的無(wú)血清培養(yǎng)液治療小鼠。一周后以相同劑量加強(qiáng)治療。7天后處死部分老鼠取出腫瘤測(cè)量腫瘤重量、小鼠祛瘤凈重和腫瘤體積，剩余小鼠用于觀察腫瘤生長(zhǎng)情況及生存時(shí)間、生存率等。比較各組有無(wú)差異。⑤DC瘤苗促腫瘤細(xì)胞凋亡作用的觀察研究：剝離的小鼠腫瘤分別制成單細(xì)胞懸液和組織切片，分

5、別采用 AnnexinV-FITC/PI、TUNEL 法對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行測(cè)定，比較各組有無(wú)差異。 結(jié)果：①用IL-4 聯(lián)合GM-CSF培養(yǎng)小鼠骨髓細(xì)胞3天后，可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，并呈簇生長(zhǎng)。培養(yǎng)第6～8天，細(xì)胞表面出現(xiàn)較多毛刺樣突起，拉長(zhǎng)，為典型的DC特征。流式細(xì)胞儀檢測(cè) DC 表面分子有CD80、CD86、H-2Kd及 I-Ad 表達(dá)；②應(yīng)用不同劑量的 HIFU 輻照小鼠 CT-26結(jié)腸癌細(xì)胞時(shí)，隨著

6、HIFU輻照劑量的增加，腫瘤細(xì)胞存活率迅速減低，腫瘤細(xì)胞的碎片逐漸增多。超聲劑量為1000W/cm<'2>×30 秒時(shí)，細(xì)胞全部死亡，失去細(xì)胞形態(tài)并全部被撅裂成碎片。因此，選用 1000W/cm<'2>×30 秒作為制備腫瘤細(xì)胞裂解液(腫瘤細(xì)胞抗原)的工作劑量。③ HIFU輻照組、反復(fù)凍融組分別與單純DC組、陰性對(duì)照組比較腫瘤重量、體積、小鼠的凈重等差異均有顯著性意義(P<0.01或P<0.05)； HIFU輻照組、反復(fù)凍融組分別與單純

7、DC組、陰性對(duì)照組比較小鼠的生存時(shí)間和生存率，差異具有顯著性意義(P<0.01或P<0.05)；HIFU 輻照組與反復(fù)凍融組比較腫瘤重量、體積等差異亦有顯著性意義(P<0.01 或 P<0.05)、HIFU 輻照組與反復(fù)凍融組比較小鼠的凈重、小鼠生存時(shí)間和生存率異亦無(wú)顯著性意義(P>0.05)。④HIFU 輻照組、反復(fù)凍融組分別與單純DC組、陰性對(duì)照組比較腫瘤細(xì)胞凋亡情況差異亦有顯著性意義 (P<0.01或P<0.05)。HIFU 輻照

8、組與反復(fù)凍融組比較腫瘤細(xì)胞凋亡情況差異亦有顯著性意義 (P<0.05)。說(shuō)明 HIFU 輻照法制備的DC瘤苗和的反復(fù)凍融法制備的DC瘤苗均具有抵抗腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而治療腫瘤的作用，而且前者由于后者。 結(jié)論：①應(yīng)用 IL-4 聯(lián)合 GM-CSF培養(yǎng)小鼠骨髓細(xì)胞，可大量擴(kuò)增成熟DC，培養(yǎng)的 DC 符合其自身的特性。②HIFU 能滅活腫瘤細(xì)胞且能破碎腫瘤細(xì)胞，1000W/cm<'2>×30s 可作為制備腫瘤細(xì)胞抗原的工作