應(yīng)用攪拌式生物反應(yīng)器體外擴(kuò)增人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 近年來研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)不僅支持造血系統(tǒng)，還可以向中胚層和外胚層來源的組織分化，在特定的培養(yǎng)條件下可向骨、成骨、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及肌細(xì)胞分化，且MSCs的免疫原性較低，在異基因移植中，用不相關(guān)供者的MSCs做滋養(yǎng)層支持造血干細(xì)胞(haemopoietic stemcell，HSC)體外擴(kuò)增并不引起異體淋巴細(xì)胞反應(yīng)。因而，MSCs在臨床上具有廣泛的應(yīng)用前景。目

2、前，在實(shí)驗(yàn)室里，MSCs的體外擴(kuò)增主要采用小規(guī)模的靜態(tài)培養(yǎng)方式，靜態(tài)培養(yǎng)有其固有的局限性：培養(yǎng)環(huán)境不均一、培養(yǎng)參數(shù)不能及時(shí)監(jiān)測和調(diào)控以及不利于大規(guī)模的培養(yǎng)等。攪拌式生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)可以為細(xì)胞的體外擴(kuò)增提供均衡的營養(yǎng)環(huán)境，也可以在培養(yǎng)過程中對細(xì)胞代謝和培養(yǎng)液進(jìn)行監(jiān)控。人胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(human placenta-derived mesenchymal stem cells，hPDMSCs) 不僅來源廣泛，且對其研究不會(huì)涉及倫理

3、道德和法律問題，因此成為人類MSCs新的來源。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用攪拌式生物反應(yīng)器體外擴(kuò)增hPDMSCs，通過檢測細(xì)胞體外擴(kuò)增速率、細(xì)胞表面標(biāo)記物、細(xì)胞周期、細(xì)胞代謝及培養(yǎng)液的PH和滲透壓的變化，探討體外大量擴(kuò)增干細(xì)胞的方法。 方法： 1、分離培養(yǎng)hPDMSCs：取足月剖宮產(chǎn)胎兒胎盤子體面組織，PBS沖洗去除血跡，采用組織微塊貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)hPDMSCs。 2、Cytodex-3型微載體及攪拌式生物反應(yīng)器的預(yù)處理：以1

4、0 mg/ml稱取適量的cytodex-3微載體，PBS浸泡過夜、清洗、高壓滅菌、0.2％明膠包被后備用。無水乙醇浸泡攪拌式生物反應(yīng)器過夜，三蒸水反復(fù)沖洗，高壓滅菌后備用。 3、攪拌式生物反應(yīng)器體外擴(kuò)增 hPDMSCs：分別將1×107cells接種于微載體上制備成細(xì)胞懸液，在培養(yǎng)瓶內(nèi)預(yù)培養(yǎng)24 h后，將該懸液轉(zhuǎn)移至攪拌式生物反應(yīng)器內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，逐漸調(diào)整攪拌式生物反應(yīng)器至適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)數(shù)，同時(shí)設(shè)置靜態(tài)培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶為對照組。每2d半量換液

5、一次。 4、hPDMSCs的生長與代謝變化的檢測：每日分別從培養(yǎng)瓶中和生物反應(yīng)器內(nèi)取樣，檢測細(xì)胞的擴(kuò)增速率和培養(yǎng)液的PH、乳酸含量、葡萄糖含量、滲透壓。 5、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物與細(xì)胞周期：取應(yīng)用攪拌式生物反應(yīng)器培養(yǎng)前、后的hPDMSCs，流式細(xì)胞儀檢測CD13、CD14、CD29、CD31、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD166、HLA-DR、HLA-ABC的表達(dá)情況及細(xì)胞周期的變化并進(jìn)

6、行比較。 結(jié)果： 1、胎盤中提取的MSC形態(tài)：呈梭形或成纖維狀，傳至20代時(shí)仍可穩(wěn)定生長。 2、人胎盤組織來源的細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)記特征：表達(dá)CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、HLA-ABC，不表達(dá)CD14、CD31、CD45、HLA-DR。 3、hPDMCs的生長與代謝的變化 (1)hPDMCs在cytodex-3型微載體上的貼附情況：對照組hPDMCs較為明

7、顯的黏附在微載體的周圍，但僅看到少數(shù)微載體間的搭橋現(xiàn)象，且參與的微載體的個(gè)數(shù)較少；而在攪拌式生物反應(yīng)器中，微載體大都通過細(xì)胞基質(zhì)黏附在一起，呈現(xiàn)明顯的搭橋現(xiàn)象。 (2)hPDMCs的生長曲線：對照組中的hPDMCs開始以較為平緩的趨勢擴(kuò)增，而且細(xì)胞密度一直呈現(xiàn)升高的趨勢并在第4d達(dá)峰值，隨后，細(xì)胞的密度就出現(xiàn)較為明顯的下降趨勢；攪拌式生物反應(yīng)器中的hPDMCs在剛接入的48 h內(nèi)，其擴(kuò)增趨勢較對照組略低，隨后細(xì)胞出現(xiàn)明顯擴(kuò)增的跡

8、象。 (3)hPDMCs的擴(kuò)增倍數(shù)：hPDMCs在攪拌式生物反應(yīng)器中每代可以擴(kuò)增10.55±1.62倍，明顯高于對照組的6.10±0.11倍的擴(kuò)增值(P<0.05)。 (4)營養(yǎng)物質(zhì)的消耗與代謝：攪拌式生物反應(yīng)器內(nèi)的葡萄糖消耗較對照組的高，但乳酸的生成卻較對照組的低。 (5)培養(yǎng)液的PH值的變化：反應(yīng)器內(nèi)的PH變化幅度較對照組的小。 (6) 培養(yǎng)液的滲透壓的變化：反應(yīng)器和對照組內(nèi)培養(yǎng)液的滲透壓均維持在(2

9、80-320)mmol/kg之間。 4、hPDMCs表面標(biāo)記特征及細(xì)胞周期在生物反應(yīng)器培養(yǎng)前、后的變化：流式細(xì)胞儀檢測應(yīng)用攪拌式生物反應(yīng)器培養(yǎng)前、后的細(xì)胞表面標(biāo)記特征及細(xì)胞周期無明顯改變(P>0.05)。 結(jié)論： 1、胎盤中存在著豐富的MSCs，不僅來源廣泛，且對其研究不會(huì)涉及倫理道德和法律問題，為人類提供了新的干細(xì)胞種子來源。 2、攪拌式生物反應(yīng)器為hPDMSCs提供了一種理想的體外擴(kuò)增的三維培養(yǎng)體系，