毛細(xì)管電泳分析肺癌基因及相關(guān)蛋白質(zhì)的方法學(xué)研究.pdf

1、腫瘤是多因素作用下，多階段演化而成。隨著各種檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展及學(xué)科之間的滲透，一些腫瘤生物指標(biāo)從最初的分子生物學(xué)檢測(cè)發(fā)展到化學(xué)檢測(cè)。本論文以分析化學(xué)的檢測(cè)方法毛細(xì)管電泳(CE)對(duì)肺癌DNA，蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，并對(duì)聚環(huán)氧乙烷(PEO)中添加納米材料金納米粒子(GNPs)后的新型篩分介質(zhì)進(jìn)行研究。
　　 第一部分從DNA角度以CE、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)結(jié)合經(jīng)典突變點(diǎn)分析方法：?jiǎn)捂湗?gòu)象多態(tài)性(SSCP)和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(R

2、FLP)對(duì)肺癌及癌旁正常組織p53基因第七外顯子突變情況進(jìn)行檢測(cè)，從上樣量、時(shí)間、檢測(cè)限和檢出率四個(gè)方面進(jìn)行比較。檢出率由高到低分別為：CE-SSCP＞PAGE-SSCP＞CE-RFLP＞PAGE-RFLP。CE-SSCP可作為大規(guī)模肺癌早期診斷DNA指標(biāo)簡(jiǎn)便可靠的方法。
　　 第二部分首先建立無(wú)膠篩分毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光(NGS-CE-LIF)檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法，改進(jìn)后對(duì)提取肺癌及癌旁正常組織蛋白質(zhì)混合物(變性/活性)差異進(jìn)

3、行檢測(cè)。該法可對(duì)6.5～200kDa范圍蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，具有篩分介質(zhì)濃度調(diào)節(jié)簡(jiǎn)便、分離效果好、時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，理論塔板數(shù)(N)均值為9.12×104/m，檢出限為2.8×10-4 mg/ml。肺癌組織與正常組織相比有較明顯蛋白質(zhì)種類(lèi)及表達(dá)量差異，且主要集中在20～116kDa。常用蛋白質(zhì)分析方法：變性 SDS-PAGE及活性藍(lán)綠溫和膠電泳(BN-PAGE)結(jié)果與NGS-CE-LIF結(jié)果大致相同，并且PAGE檢測(cè)不出的蛋白質(zhì)CE-LIF也能

4、檢測(cè)出來(lái)。
　　 第三部分合成13 nm的GNPs，透射電子顯微鏡(TEM)對(duì)GNPs尺寸進(jìn)行測(cè)量，以PEO-GNPs-TBE(Tris-Boric acid-EDTA)作為CE篩分介質(zhì)，考察分離參數(shù)：篩分介質(zhì)濃度，分離電壓，溫度和篩分介質(zhì)pH值對(duì)DNA片段分離的影響。用Ogston模型、偏爬行模型解釋相關(guān)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，對(duì)分離機(jī)理進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明添加GNPs的這種新型篩分介質(zhì)分離效果好且時(shí)間短，適于分離較寬范圍(100～100