乙肝病毒相關(guān)肝病血清分子標志物的篩選、驗證和診斷價值.pdf

1、原發(fā)性肝癌是中國常見的惡性腫瘤之一,早期診斷率不高,預后差,5年生存率低。AFP是目前廣泛應用于診斷肝癌的血清學標志物,但是有1/3的肝癌患者AFP表達為陰性;其他血清學標志物,如堿性磷酸酶、γ羧基凝血酶原和一些組織特異的抗原等,臨床診斷價值都不理想。在小肝癌(＜3 cm)中AFP陽性率更低,僅為25％,臨床表現(xiàn)較輕且缺乏特異性,診斷依賴于多種影像學檢查和病理學檢查,在臨床上應予以高度重視。因此,迫切需要發(fā)現(xiàn)AFP陰性肝癌新的早期生物標

2、志物。近年來,穩(wěn)定同位素標記結(jié)合質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組(iTRAQ)技術(shù)方法的建立,使肝癌新標志物的發(fā)現(xiàn)提升到一個更高的水平。
　　本研究通過去除血清中的高豐度蛋白,聯(lián)合定量蛋白質(zhì)組技術(shù),篩選出一組與AFP陰性肝癌患者相關(guān)的有潛在應用價值的差異蛋白質(zhì),并利用生物信息學分析挑選的關(guān)鍵分子,通過免疫印跡和組織芯片進行表達驗證,建立ROC診斷模型;并對血清結(jié)合珠蛋白β亞基的表達和其N-聚糖在乙肝病毒相關(guān)肝病的診斷價值進行了系統(tǒng)分析。

3、　　第一部分 AFP陰性肝癌患者血清學標志物篩選、驗證和診斷價值(iTRAQ2D-LC ESI-MS/MS)
　　本部分的目的在于篩查AFP陰性肝癌患者表達相關(guān)的差異分子。所有血清均取自我院和廣西醫(yī)科大學標本庫,均有完整的生化資料和臨床病理資料,根據(jù)AFP陰性和陽性,分為AFP陰性肝硬化組,AFP陰性肝癌組和AFP陽性肝癌組。通過MARS柱去除血清中的14種高豐度蛋白進一步濃縮后,分別進行穩(wěn)定同位素114,115和117 iTRA

4、Q標記,經(jīng)過強陽離子柱分離和反相色譜柱分離,質(zhì)譜鑒定分析差異蛋白,應用生物信息學工具進行統(tǒng)計分析和解讀,同時利用免疫印跡方法對AFP陰性和陽性的肝硬化和肝癌樣本中對部分差異蛋白進行小樣本驗證;并采用免疫組化的方法檢測肝癌相關(guān)肝病組織切片(AFP陰性肝硬化和早期肝癌)中PON1的表達。最后,利用免疫印跡方法對46例肝硬化和28例AFP陰性的肝癌病人血清樣本的PON1和ATⅢ的表達進行了驗證。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)iTRAQ肽段實驗標記,

5、Q-star質(zhì)譜最多得到17034個有差別的肽段,MASCOT搜庫(去冗余后)鑒定到494個蛋白(95％可信度)。在三次實驗中,分別鑒定到的蛋白數(shù)量分別為224、350和276個。按照Ratio＞1.2(上調(diào))或Ratio＜0.8(下調(diào)),且P＜0.05為標準篩選,共有81個含定量信息的差異表達蛋白。其中表達上調(diào)1.2倍以上蛋白45個,表達下調(diào)1.2倍以上蛋白共36個。利用生物信息學技術(shù)在GO分類、生物通路和蛋白質(zhì)相互作用STRING網(wǎng)

6、絡(luò)水平上進行研究,發(fā)現(xiàn)與炎癥與凋亡相關(guān)的通路被激活;免疫印跡驗證顯示,PON1在血清AFP陰性的肝硬化中表達高于AFP陰性肝癌組,ATⅢ在血清AFP陰性的肝硬化中表達低于AFP陰性肝癌組。經(jīng)Logist回歸分析,兩種蛋白的AUC(ROC曲線下面積)分別為0.676和0.793,兩者聯(lián)合診斷面積為0.834。
　　結(jié)果表明,低豐度蛋白的富集結(jié)合定量蛋白質(zhì)組學,是較新的、可行的蛋白質(zhì)組學研究策略之一。本研究篩查出與AFP陰性肝硬化和肝

7、癌患者相關(guān)的差異蛋白PON1和ATⅢ,可能作為AFP陰性肝癌患者早期診斷或輔助診斷的分子標志。
　　第二部分血清結(jié)合珠蛋白β亞基的表達和糖基化在乙肝病毒相關(guān)肝病的診斷價值
　　本部分的目的是研究血清結(jié)合珠蛋白β亞基(Hp-β)的蛋白和其巖藻糖基化在乙肝病毒相關(guān)肝病過程中的診斷價值。利用免疫比濁法檢測乙肝病毒相關(guān)的肝病過程(慢性遷延性肝炎(HBV組)、肝硬化(LC組)和肝癌(HCC組))中Hp含量的變化,特別是分析血清AFP陰

8、性的肝硬化和肝癌患者血清中Hp含量變化及其診斷價值。此外,以正常血清樣本(N組)為對照,利用凝集素印跡分析乙肝病毒相關(guān)的肝病過程中Hp-β糖鏈的變化,HPLC分析Hp-β糖鏈結(jié)構(gòu),并進一步用免疫印跡驗證。
　　結(jié)果表明,Hp蛋白含量在肝病的進程中,呈先降低、再升高的趨勢。Hp在區(qū)別AFP陰性肝硬化和和肝癌的AUC為0.763,敏感性和特異性分別為63.3％和80.2％。在Hp-β的糖鏈變化上,肝硬化組和肝癌組的AAL凝集素特異性結(jié)

9、合能力比正常組和肝炎組高,有統(tǒng)計學差異。說明在肝硬化組和肝癌組中Hp-β所含末端巖藻糖增多。此外,SNA凝集素結(jié)合實驗表明,正常對照組、肝炎組和肝癌組中結(jié)合的唾液酸比肝硬化組多。經(jīng)HPLC分析,Hp-β亞基中增高的巖藻糖結(jié)構(gòu)為Lewis x,這一結(jié)果經(jīng)過了抗Lewis x的抗體免疫印跡驗證。
　　本研究發(fā)現(xiàn),Hp-β母蛋白水平可以區(qū)分AFP陰性肝硬化和肝癌患者,而Hp-β的Lewis x水平可作為區(qū)分肝炎和肝硬化的標準物,進一步說

10、明它在乙肝病毒相關(guān)肝病過程中有著重要的診斷價值。
　　結(jié)論
　　1.應用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù),對AFP陰性肝硬化、AFP陰性肝癌和AFP陽性肝癌患者的血清樣本比較,鑒定出494個蛋白,三次生物學重復去冗余后,P＜0.05的差異表達的蛋白有81個,在AFP陰性肝癌中表達上調(diào)蛋白45個,表達下調(diào)蛋白36個;
　　2.PON1和ATⅢ聯(lián)合的AUC(ROC曲線下面積)為0.834,敏感度為46.43％,特異度為9

11、5.65％,可能作為AFP陰性肝癌患者早期診斷和輔助診斷的分子標志。
　　3.Hp蛋白含量在肝病的進程中呈現(xiàn)先降低再升高的趨勢,區(qū)分AFP陰性肝硬化和肝癌患者AUC為0.763,敏感性和特異性分別為63.3％和80.2％,存在一定的診斷價值;
　　4.Hp-β糖鏈中含有Lewis x結(jié)構(gòu),在肝硬化和肝癌中的含量比正常組都高,可以作為區(qū)分肝炎和肝硬化的潛在標志物。
　　潛在應用價值
　　1.PON1和ATⅢ可作為A

12、FP陰性肝癌的預測指標。
　　2.血清結(jié)合珠蛋白β鏈在在蛋白水平和糖基化水平變化的不一致,有助于對肝病患者的早期診斷。
　　創(chuàng)新點1.低豐度蛋白的富集結(jié)合定量蛋白質(zhì)組學技術(shù),克服了以往傳統(tǒng)技術(shù)上的一些弱點,并且采用AFP陰性的患者直接進行血清定量蛋白組學的分析,區(qū)別于以往的AFP陰性患者和其它肝癌患者混在一起研究,篩查出一組關(guān)鍵差異蛋白分子,對AFP陰性肝癌診斷和治療有所幫助。
　　2.證實血清差異蛋白PON1和ATⅢ