西酞普蘭對(duì)全腦缺血VD大鼠神經(jīng)發(fā)生的影響及5-HT-,1A-受體機(jī)制初探.pdf

1、血管性癡呆(VD)是僅次于阿爾采默病(AD)引起老年期癡呆的常見病因，嚴(yán)重危害老年人生存質(zhì)量，但迄今還沒(méi)有治療vD的有效方法。VD大多由于腦血流量明顯減低導(dǎo)致的腦灌注不足所致，對(duì)缺血缺氧非常敏感的海馬在VD的認(rèn)知功能障礙的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。由于大量研究證實(shí)成年腦內(nèi)存在具有增殖與分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)，比如海馬齒回(DG)和室下區(qū)(SVZ)等，尤其是海馬NSCs的增殖、分化、遷移和整合因與學(xué)習(xí)記憶過(guò)程密切相關(guān)，給治療VD帶來(lái)

2、了新的希望。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血可以激活腦內(nèi)NSCs增殖、遷移和分化，但是腦缺血后增強(qiáng)的神經(jīng)發(fā)生并不能代償因缺血而造成的神經(jīng)元丟失和海馬的學(xué)習(xí)記憶功障礙，所以目前創(chuàng)造合適的微環(huán)境，進(jìn)一步激活自身的NSCs和內(nèi)源性修復(fù)已成為一個(gè)重要的研究方向。在這一方面，5-HT和選擇性中樞5-HT再攝取抑制劑(SSRIs)類藥物倍受關(guān)注。此外研究發(fā)現(xiàn)，5-HT1A受體不僅在海馬含量豐富，而且是5-HT介導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生的主要受體。盡管如此，目前仍缺乏有關(guān)SS

3、RIs對(duì)腦缺血神經(jīng)發(fā)生及認(rèn)知障礙作用及作用機(jī)制的研究。 基于上述理由，我們假設(shè)：SSRIs類藥物西酞普蘭(CIT)可促進(jìn)VD大鼠腦內(nèi)NSCs增殖及分化，并進(jìn)而改善大鼠認(rèn)知功能，而且此過(guò)程受到5-HT1A受體功能的調(diào)控。本研究可為腦缺血海馬神經(jīng)發(fā)生的調(diào)控提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也可為臨床干預(yù)腦缺血性認(rèn)知功能障礙提供新的思路。 研究目標(biāo)： 1.闡明VD大鼠腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的時(shí)空關(guān)系； 2.明確CIT對(duì)腦內(nèi)不同部

4、位NSCs增殖和分化的作用及其對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響； 3.初步闡明CIT促腦缺血神經(jīng)發(fā)生及影響認(rèn)知功能的機(jī)制：5-HT及5-HT1A受體的作用探討。 研究方法： 1.動(dòng)物分組及處置：Wistar大鼠(n=336)隨機(jī)分為正常正常對(duì)照組(NC)、假手術(shù)對(duì)照組(SC)、血管性癡呆組(VD)、西酞普蘭干預(yù)的血管性癡呆組(VD-C)以及西酞普蘭和WAY100635聯(lián)合干預(yù)組(VD-CW)，后四組按手術(shù)后時(shí)相點(diǎn)每組分術(shù)后1

5、、3、7、14、21、42d組。CIT20mg/kg、WAY1006350.3mg/kg腹腔注射，1次/d，21天后造模，造模后持續(xù)給藥至相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)。BrdU50mg/kg腹腔注射，每天1次，第7次注射后12h處死動(dòng)物用于NSCs增殖的研究；對(duì)各實(shí)驗(yàn)組術(shù)后14d亞組，每天1次，第7次注射后28d處死大鼠用于NSCs分化的研究。采用改良的Pulsinelli’s四血管阻斷法制作VD動(dòng)物模型 2.動(dòng)物認(rèn)知功能檢測(cè)：Morris水迷宮

6、定位航行實(shí)驗(yàn)和空間搜索實(shí)驗(yàn)檢測(cè)平均逃逸潛伏期(EL)、平臺(tái)象限游泳距離百分比(DP)和穿越平臺(tái)次數(shù)反映大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶功能；大鼠電生理檢測(cè)類P3波潛伏期(類P3L)。 3.NSCs增殖的觀察：采用免疫組織化學(xué)方法，35μm新鮮冰凍切片0.3％TritonX-100和2NHCl處理后，SABC法Cy3免疫熒光或DAB顯色后，顯微鏡下觀察拍照。 4.NSCs分化的觀察：采用：BrdU免疫熒光雙標(biāo)記的方法，BrdU免疫熒光標(biāo)

7、記后，分別加GFAP或Tui-1或Calbindin-D28k抗體，各自標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞、幼稚和成熟神經(jīng)元及成熟神經(jīng)元，另一熒光顯色系統(tǒng)顯色后，倒置熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。 5.尼氏染色檢測(cè)海馬CA1神經(jīng)元存活情況。 6.5-HT1A受體表達(dá)測(cè)定：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法，上游引物5’-GCCCCCCAAGAAGAGCCTGA-3’，下游引物5’-GCCATCTTGCGCTTTGCTTC-

8、3’。內(nèi)參照物GAPDH上游引物：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。先后進(jìn)行總RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。以相對(duì)表達(dá)豐度反映5-HT1A受體mRNA表達(dá)。 7.高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)海馬和皮層神經(jīng)遞質(zhì)的含量。 8.細(xì)胞計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：形態(tài)學(xué)研究組織切片均在同一放大倍數(shù)下分析(免疫組織和免疫熒光化學(xué)200×，組織化

9、學(xué)400×)，應(yīng)用IPP6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。 研究結(jié)論： 1.全腦缺血再灌注可誘導(dǎo)成年大鼠腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生增強(qiáng)，以海馬DG和SVZ區(qū)新生神經(jīng)細(xì)胞的增殖最明顯，海馬CA1、CA2區(qū)和PCg皮層也發(fā)現(xiàn)腦缺血后神經(jīng)發(fā)生增強(qiáng)的現(xiàn)象。海馬和皮層增強(qiáng)的神經(jīng)發(fā)生在術(shù)后14d達(dá)高峰，21d開始下降，一直可持續(xù)到術(shù)后42d；而SVZ神經(jīng)發(fā)生的高峰出現(xiàn)在術(shù)

10、后7d。大鼠腦缺血再灌注后水迷宮和類P3認(rèn)知功能的改變，與海馬及皮層BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的增殖沒(méi)有相關(guān)性。 2.CIT可顯著促進(jìn)VD大鼠海馬DG、CA1、CA2區(qū)和皮層的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞增殖，對(duì)SVZ區(qū)的新生神經(jīng)細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響。同時(shí)，CIT可顯著促進(jìn)海馬DG、CA1區(qū)和皮層新生神經(jīng)細(xì)胞的成神經(jīng)元分化，并且該作用與CIT改善VD大鼠認(rèn)知障礙的效應(yīng)關(guān)系密切。CIT的上述作用可被聯(lián)合應(yīng)用WAY100635所逆轉(zhuǎn)。 3.CIT促