妊娠期母鼠接觸SEB對新生鼠胸腺及外周T細胞的影響.pdf

1、目的：
　　金黃色葡萄球菌腸毒素B（Stap hyloc occa l e nte roto xin B，SEB）既是一種毒素性物質，又是葡萄球菌腸毒素家族9個血清型中最重要和研究較多的超抗原。SEB作為一種超抗原，無需經過抗原遞呈細胞的識別和加工，就可以直接通過橋聯抗原遞呈細胞的MHCⅡ類分子結合槽外側區(qū)與T淋巴細胞TC R的Vβ區(qū)，刺激機體免疫系統(tǒng)大量的T細胞活化。通常SEB進入機體后，初期可短暫激活Vβ8+T細胞并誘發(fā)大量增

2、殖，繼而過度增殖的細胞發(fā)生凋亡導致克隆清除，而出現中樞或外周耐受。盡管有許多關于 SEB對成年動物及新生鼠免疫器官、T淋巴細胞及細胞因子影響的研究，但妊娠期母鼠接觸 SEB對子代新生鼠細胞免疫的影響，目前國內外未見報道。因此，我們選用妊娠16天孕鼠尾靜脈注射15μg SEB，同時建立PBS對照，在子代新生鼠出生后第0-5天檢測胸腺、脾臟及外周血中CD4/CD8 T細胞及TCR Vβ8+T細胞亞群；通過新生鼠胸腺體外培養(yǎng)觀察 ConA或

3、SEB刺激后胸腺細胞的分化發(fā)育；通過脾臟淋巴細胞體外培養(yǎng)觀察其對ConA或S EB刺激的增殖應答情況。
　　方法：
　　1.選用清潔級成年SD大鼠，交配及確定受孕后，孕鼠飼養(yǎng)至妊娠16天隨機分組，每組12只，實驗組（SEB組）孕鼠通過尾靜脈注射15μg的S EB，同時設立對照組，給予等體積的PBS（磷酸鹽緩沖液）。
　　2.在妊娠期滿（21天）時，用4％水合氯醛麻醉孕鼠后打開腹腔和子宮，取出胎鼠并分離胸腺和脾臟，稱量胎

4、體、胎盤、胸腺及脾臟的干濕重。
　　3.在新生鼠出生后的第0-5天，獲取每組新生鼠的胸腺、脾臟和外周血，用網搓法制備胸腺及脾臟的單細胞懸液，脾臟的單細胞懸液及外周血用紅細胞裂解液去除紅細胞。將獲得的細胞懸液分為兩份，一份用熒光抗體CD3-FITC、CD4-APC和CD8-PE進行細胞染色，另一份用Vβ8.2-FITC、CD4-APC和C D8-PE進行染色，染色后經流式細胞儀檢測T細胞亞群的比例。
　　4.無菌分離出生后第0

5、天的兩組新生鼠胸腺，采用胸腺器官培養(yǎng)法（thymus organ culture，TOC）進行體外培養(yǎng)，并加入ConA或SEB共培養(yǎng)三天。在培養(yǎng)結束時收集胸腺并制備單細胞懸液，染色后經流式細胞儀檢測胸腺中T細胞亞群的比例。
　　5.無菌分離出生后第3天的兩組新生鼠脾臟，用淋巴細胞分離液分離脾臟淋巴細胞，體外與ConA或S EB連續(xù)共培養(yǎng)三天。在第1、2、3天培養(yǎng)結束時，收集脾臟淋巴細胞，染色后經流式細胞儀檢測脾臟中T細胞亞群的比例

6、。若檢測脾臟淋巴細胞增殖能力時，在每一時間點結束前5小時加入3H-TDR共培養(yǎng)至結束，然后通過γ計數儀檢測rp m.
　　結果：
　　1.妊娠期母鼠接觸SEB后對胎鼠體重等指標的影響
　　妊娠期第16天母鼠靜脈注射SEB后，可明顯減少胎鼠胸腺及脾臟的濕重和干重(P<0.01)；但與PBS組比較，S EB組的胎體及胎盤的干、濕重無統(tǒng)計學差異。
　　2.妊娠期母鼠接觸SEB對新生鼠中樞及外周CD4/CD8 T細胞亞群

7、的影響
　　2.1妊娠期母鼠接觸SEB對新生鼠胸腺中C D4/CD8 T細胞亞群的影響
　　妊娠期第16天母鼠接觸SEB后，在新生鼠出生后的第0-5天，SEB組新生鼠胸腺中CD4+T細胞的比例明顯高于PBS組(P<0.01或P<0.05)，而SEB組CD8+T細胞的比例明顯低于PBS組的(P<0.01或P<0.05)。
　　2.2妊娠期母鼠接觸SEB對新生鼠脾臟中C D4/CD8 T細胞亞群的影響
　　在新生鼠出

8、生后第0-5天，SEB組新生鼠脾臟中CD4+T細胞的比例在各時間點均明顯高于PBS組(P<0.01或P<0.05)。但兩組在各時間點的CD8+T細胞比例無統(tǒng)計學差異。
　　2.3妊娠期母鼠接觸SEB對新生鼠外周血中C D4/CD8 T細胞亞群的影響
　　在新生鼠出生后第0-5天，PBS組和SEB組新生鼠外周血CD4+T細胞與CD8+T細胞亞群比例的總體變化趨勢與脾臟中的相類似。兩組外周血中C D4/C D8 T細胞比值均呈上

9、升趨勢，從第0-1天的比值小于1逐漸增加到之后的大于1，但SEB組在各時間點的CD4/CD8 T細胞的比值均明顯高于PBS組(P<0.01或P<0.05)。
　　3.妊娠期母鼠接觸SEB對新生鼠中樞及外周TC R Vβ8.2+T細胞的影響
　　妊娠期第16天母鼠接觸SEB后，在新生鼠出生后的第0-3天，SEB組新生鼠胸腺中的CD4+TCR Vβ8.2+ T細胞比例較PBS組的明顯減少(P<0.01或P<0.05)，在第4-5

10、天兩組的CD4+TCR Vβ8.2+ T細胞比例趨于平穩(wěn)，且無統(tǒng)計學差異；而在出生后的第0-5天，SEB組新生鼠胸腺及外周血中CD8+TCR Vβ8.2+T細胞比例及外周血中的CD4+TCR Vβ8.2+T細胞比例均較PBS組的明顯減少(P<0.01或P<0.05)。
　　4.妊娠期母鼠接觸SEB對體外培養(yǎng)新生鼠胸腺分化發(fā)育的影響
　　4.1妊娠期母鼠接觸SEB對體外培養(yǎng)新生鼠胸腺中CD4/CD8 T細胞亞群的影響
　

11、　PBS組和SEB組新生鼠胸腺體外與Co nA或S EB共培養(yǎng)三天后，SEB組新生鼠胸腺中CD4+T細胞及CD8+T細胞的比例在Co nA（S EB+Co nA組）或S EB（S EB+S EB組）刺激后均較PBS組（PBS+Co nA組；PBS+S EB組）的明顯減少(P<0.01或P<0.05)；而SEB組CD4+CD8+T細胞的比例較P BS組明顯增加(P<0.01或P<0.05)，但胸腺中CD4-CD8-T細胞的比例在兩組間無統(tǒng)

12、計學差異。
　　4.2妊娠期母鼠接觸SEB對體外培養(yǎng)新生鼠胸腺中TC R Vβ8.2+T細胞的影響
　　PBS組和SEB組新生鼠胸腺體外與Co nA或S EB共培養(yǎng)三天后，SEB組的CD4+TCR Vβ8.2+T細胞和CD8+TC R Vβ8.2+T細胞比例均較P BS組明顯減少(P<0.01或P<0.05)。
　　5.妊娠期母鼠接觸SEB對新生鼠脾臟淋巴細胞體外增殖的影響
　　5.1妊娠期母鼠接觸SEB對新生鼠

13、脾臟T淋巴細胞亞群增殖的影響
　　PBS組和S EB組新生鼠脾臟淋巴細胞體外與ConA或S EB共培養(yǎng)三天后，SEB組CD4+T細胞比例在Co nA或SEB刺激第一天分別較PBS組明顯增加，但在第2-3天卻明顯降低(P<0.01或P<0.05)，但兩組的CD8+T細胞比例無統(tǒng)計學差異。而SEB組新生鼠脾臟淋巴細胞中CD4+TCR Vβ8.2+T細胞比例在ConA或S EB刺激的第1天及CD8+TCR Vβ8.2+ T細胞比例在連續(xù)

14、刺激三天分別較P BS組的明顯增加(P<0.01或P<0.05)，但兩組CD4+TC R Vβ8.2+T細胞比例在Co nA或S EB刺激的第2-3天無差異性。
　　5.2妊娠期母鼠接觸SEB對新生鼠脾臟淋巴細胞增殖指數的影響
　　PBS組和SEB組新生鼠脾臟淋巴細胞體外與ConA或SEB共培養(yǎng)三天后，3H摻入法檢測結果發(fā)現SEB組新生鼠脾臟淋巴細胞在Co nA或S EB刺激后第1天增殖能力明顯強于PBS組，但在第2-3天的

15、增殖能力卻又明顯低于P BS組(P<0.01或P<0.05)。
　　結論：
　　1.妊娠期母鼠接觸SEB可明顯影響胎鼠胸腺及脾臟的發(fā)育；
　　2.妊娠期母鼠接觸 S EB可通過中樞和外周兩種克隆清除方式導致新生鼠 TCRVβ8.2+T細胞比例減少，但S EB并非僅僅作用于TC R Vβ8.2+T細胞，可能對其它的T淋巴細胞也產生影響；
　　3.在受到抗原刺激時，妊娠期母鼠接觸 SEB并不影響新生鼠胸腺中 DN細胞