β-淀粉樣蛋白在大鼠視神經(jīng)橫斷損傷模型中的表達(dá)及BFP對(duì)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞通常在受到損傷或退行性變后軸突不能再生，但最近10余年來(lái)的研究表明我們可以通過(guò)激活節(jié)細(xì)胞固有的生長(zhǎng)狀態(tài)、維持它們的生存能力及抵制外環(huán)境的抑制信號(hào)達(dá)到部分再生的狀況。主要為以下三個(gè)方面：1.阻止神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的繼續(xù)發(fā)生。例如：谷氨酸受體拮抗劑；鈣通道阻滯劑；一氧化氮(NO)與其合酶(NOS)抑制劑；基因調(diào)控凋亡；自由基清除劑和抗氧化劑；熱休克蛋白；鋅等。2.促進(jìn)新的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的再生。例如：補(bǔ)充外源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；視神經(jīng)干細(xì)胞移

2、植；雪旺細(xì)胞玻璃體腔移植等。3.修復(fù)已發(fā)生凋亡的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。例如：補(bǔ)充外源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；視神經(jīng)干細(xì)胞移植；雪旺細(xì)胞玻璃體腔移植以及各種中醫(yī)藥等。這些研究成果使得視神經(jīng)的功能恢復(fù)成為可能，但是目前視神經(jīng)保護(hù)藥的種類和效果還相當(dāng)有限。中醫(yī)藥在視神經(jīng)保護(hù)方面有較大的優(yōu)勢(shì)，在積極探索視神經(jīng)損傷的發(fā)病機(jī)理的同時(shí)，加快中醫(yī)藥在視神經(jīng)保護(hù)方面的臨床和基礎(chǔ)研究，發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)，必將提高我國(guó)防盲治盲水平。烏雞白鳳丸有效成分(Bak Foong Pil

3、ls，BFP)是一種廣泛用于治療婦科疾病的傳統(tǒng)中藥，并具有類雌激素樣作用活性，如降低血壓、增加血管舒張度、減少血清三酰甘油、抗血小板活性以及刺激腦內(nèi)DA釋放等多種藥理作用。另外，謝俊霞等研究表明BFP可以抑制海馬神經(jīng)元凋亡，具有神經(jīng)保護(hù)作用。而BFP抗神經(jīng)元凋亡作用在眼科鮮有報(bào)道。我們的實(shí)驗(yàn)以SD大鼠為研究對(duì)象，觀察BFP干預(yù)處理對(duì)視神經(jīng)損傷導(dǎo)致的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡是否具有保護(hù)作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了初步探討。
　　 目的：<

4、br>　　 本研究在建立大鼠視神經(jīng)橫斷模型的基礎(chǔ)上觀察β-淀粉樣蛋白在視神經(jīng)病變時(shí)眼部的表達(dá)及其發(fā)生機(jī)制。并探討了中藥烏雞白鳳丸有效成分(BFP)對(duì)其表達(dá)的影響作用。
　　 方法：
　　 1.改良大鼠視神經(jīng)橫斷模型建立：健康SD大鼠54只，隨機(jī)分為三組，分別為損傷組(model組)、假損傷對(duì)照組(sham組)、正常對(duì)照組(control組)。Model組24只大鼠，左眼為損傷眼，右眼為未損傷眼，作為對(duì)照，按損傷后存活時(shí)

5、間不同分為3h組、48h組、7d組、14d組，每組6只，暴露視神經(jīng)，使用顯微剪縱行剝開視神經(jīng)外膜，在外膜內(nèi)、球后2 mm處離斷視神經(jīng)；Sham組24只大鼠，左眼為假損傷眼，右眼為未損傷眼，作為對(duì)照，按損傷后存活時(shí)間不同分為3h組、48h組、7d組、14d組，每組6只，僅暴露視神經(jīng)但不進(jìn)行離斷損傷；6只為正常對(duì)照組。均于處死前7 d采用雙上丘注射5％熒光金(FG)標(biāo)記雙眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。取眼球標(biāo)本并分離視神經(jīng)至視交叉。視網(wǎng)膜鋪片熒光照相

6、，RGCs計(jì)數(shù)及RGCs標(biāo)識(shí)率計(jì)算。并對(duì)視網(wǎng)膜切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，觀察視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化。
　　 2.β-淀粉樣蛋白在視神經(jīng)橫斷大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)的表達(dá)及機(jī)制：將81只健康成年S-D大鼠以第一部分相同的納入標(biāo)準(zhǔn)入組。其中損傷組(model組)和假損傷對(duì)照組(sham組)，每組36只。均使用第一章中所述的步驟在model組大鼠建立視神經(jīng)橫斷損傷模型，均損傷左眼。按損傷后存活時(shí)間不同分為3h組、48h組、7d組、14d組，

7、每組9只，暴露視神經(jīng)，使用顯微剪縱行剝開視神經(jīng)外膜，在外膜內(nèi)、球后2 mm處離斷視神經(jīng)；Sham組36只大鼠，左眼為假損傷眼，右眼為未損傷眼，作為對(duì)照，按損傷后存活時(shí)間不同分為3h組、48h組、7d組、14d組，每組9只，僅暴露視神經(jīng)但不進(jìn)行離斷損傷；9只作為正常對(duì)照組(control組)。分別于造模成功后3h、48h、7d、14d(每個(gè)時(shí)間段3只大鼠)處死動(dòng)物。①采用Western-blotting技術(shù)檢測(cè)model組、sham組及c

8、ontrol組四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的β-淀粉樣蛋白的表達(dá)情況；②使用免疫組化技術(shù)觀察model組、sham組及control組四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的β-淀粉樣蛋白的表達(dá)情況；③使用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)model組、sham組及control組四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Bcl-2 mRNA、BaxmRNA以及Caspase-3 mRNA的在視網(wǎng)膜內(nèi)的表達(dá)水平；并以control組大鼠為對(duì)照。
　　 3.BFP保護(hù)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞作用研究：將48只健康成年S-D大鼠隨機(jī)

9、分為四組：A組(損傷+BFP治療組)、B組(損傷組)、C組(損傷+PBS對(duì)照組)和D組(正常大鼠對(duì)照組)。每組12只大鼠，左眼為損傷眼，右眼為正常對(duì)照組。A組制成視神經(jīng)橫斷損傷大鼠模型，并在損傷眼玻璃體腔注射BFP溶液(100ug/ml)10ul；B組制成視神經(jīng)橫斷損傷大鼠模型；C組制成視神經(jīng)橫斷損傷大鼠模型，損傷眼玻璃體腔注射同等體積PBS；D組不進(jìn)行視神經(jīng)損傷及玻璃體腔注射。選擇第二部分中β-淀粉樣蛋白表達(dá)水平最高的時(shí)間點(diǎn)，①采用W

10、estern-blotting技術(shù)檢測(cè)model組及sham組四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的β-淀粉樣蛋白的表達(dá)；②采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)Bcl-2 mRNA、BaxmRNA以及Caspase-3 mRNA在視網(wǎng)膜內(nèi)的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功建立改良大鼠視神經(jīng)橫斷模型：①FG逆行標(biāo)記進(jìn)行RGC計(jì)數(shù)及RGCs標(biāo)識(shí)率：model組各時(shí)間點(diǎn)損傷眼RGCs計(jì)數(shù)(3h組152.06±15.21，48h組103.19±10.5

11、5，7d組61.89±27.38，14d組52.10±20.56)與control組(3h組195.16±22.12，48h組188.26±16.16，7d組187.76±21.19，14d組199.46±13.67)比較，差異均有顯著性P<0.05)。而sham組與control組比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。②組織病理改變：model組HE染色：視神經(jīng)橫斷損傷后，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層出現(xiàn)核固縮、視網(wǎng)膜各層變薄、細(xì)胞排列紊亂、視網(wǎng)

12、膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少，致傷后不同時(shí)間點(diǎn)上述改變的程度不同，表現(xiàn)為隨損傷后時(shí)間延長(zhǎng)而加重。Sham組及control組未見明顯病理改變。
　　 2.β-淀粉樣蛋白在視神經(jīng)橫斷大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)Bcl-2下調(diào)、Bax及Caspase-3上調(diào)：①應(yīng)用Western-blotting技術(shù)檢測(cè)：model組各時(shí)間點(diǎn)β-淀粉樣蛋白表達(dá)水平與control組比較，均上調(diào)，且差異有顯著性(P<0.05)。其中，以48h時(shí)間點(diǎn)上調(diào)的最高。而

13、sham組與control組比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。②應(yīng)用免疫組化技術(shù)觀察：光鏡下model組視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層及內(nèi)叢狀層均可見β-淀粉樣蛋白明顯表達(dá)，呈黃色～棕褐色顆粒狀分布。且48h時(shí)間點(diǎn)的著色最深、數(shù)量最多。而sham組與control組大鼠視網(wǎng)膜及視神經(jīng)內(nèi)未見明顯β-淀粉樣蛋白的表達(dá)。③應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)：model組Bcl-2mRNA(抗凋亡因子)表達(dá)下調(diào)，而Bax mRNA(促凋亡因子)與Caspase

14、-3mRNA(促凋亡因子)的表達(dá)上調(diào)。亦即：Bcl-2/Bax的比值下降，而Caspase-3mRNA表達(dá)水平上升，且與control組比較，差異有顯著性(P<0.05)。同時(shí)，sham組與control組比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。
　　 3.BFP下調(diào)視神經(jīng)橫斷大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)β-淀粉樣蛋白表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bax及Caspase-3表達(dá)：①應(yīng)用Western-blotting技術(shù)檢測(cè)：A組(損傷+BFP治療

15、組)與B組(損傷組)相比，β-淀粉樣蛋白的表達(dá)明顯下降，差異有顯著性(P<0.05)。但與D組比較，β-淀粉樣蛋白的表達(dá)水平仍處于升高狀態(tài)，差異有顯著性(P<0.05)。同時(shí)，B組(損傷組)與C組(損傷+PBS對(duì)照組)比較，差異均無(wú)顯著性(P>0.05)。表明玻璃體腔注射這一干預(yù)方式對(duì)，β-淀粉樣蛋白表達(dá)的影響沒有意義。②應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)：A組(損傷+BFP治療組)與正常對(duì)照組大鼠比較，仍有Bcl-2/Bax的比值下降和Casp

16、ase-3mRNA表達(dá)水平上升，且差異有顯著性(P<0.05)。但是，A組(損傷+BFP治療組)與B組(損傷組)比較，Bcl-2/Bax的比值下降和Caspase-3mRNA表達(dá)水平上升的情況明顯減輕，且差異有顯著性(P<0.05)。同時(shí)，B組(損傷組)與C組(損傷+PBS對(duì)照組)比較，差異均無(wú)顯著性(P>0.05)。表明玻璃體腔注射這一干預(yù)方式對(duì)Bcl-2mRNA、Bax mRNA以及Caspase-3mRNA表達(dá)的影響沒有意義。

17、r>　　 結(jié)論：
　　 1.應(yīng)用顯微剪縱行剝開視神經(jīng)外膜，在外膜內(nèi)、球后2mm處離斷視神經(jīng)；能成功建立改良視神經(jīng)橫斷損傷動(dòng)物模型。
　　 2.β-淀粉樣蛋白在視神經(jīng)橫斷大鼠的視網(wǎng)膜中的表達(dá)顯著上調(diào)，推測(cè)β-淀粉樣蛋白參與視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的凋亡過(guò)程。而且β-淀粉樣蛋白致視神經(jīng)損傷的機(jī)制是通過(guò)Bcl-2/Bax、Caspase-3途徑起作用的。
　　 3.烏雞白鳳丸有效成分(BFP)玻璃體腔注射通過(guò)下調(diào)β-淀粉樣蛋白的