OPG基因局部轉(zhuǎn)染治療CIA小鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RheumatoidArthritis，RA)是一種常見的慢性全身系統(tǒng)性自身免疫反應(yīng)性疾病，發(fā)病率高，病程長，慢性進(jìn)展，目前尚無有效治愈的臨床手段。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎影響著全世界約為1.0％人口身體健康，隨著年齡增長，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患病率有增長趨勢，其中65歲以上老年女性人群發(fā)病率最高，過去20年歐洲人口普查結(jié)果顯示，成年人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患病率為0.2％-0.8％，歐洲南部地區(qū)發(fā)病率較低，歐洲北部地區(qū)

2、發(fā)病率較高，美國北部的城鎮(zhèn)黑人成人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患病率高達(dá)1.01％。據(jù)統(tǒng)計RA在中國的發(fā)病率約為0.32％～0.36％，美國、英國、芬蘭成年人中RA發(fā)病率女性高于男性，約為0.2％-0.4％。長期調(diào)查研究顯示，近年來類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率已明顯下降，幾種可能的原因?yàn)樯钏教岣撸幼…h(huán)境改善，高發(fā)病率同代出生人口逐漸減少，避孕藥的大量使用，遺傳因素中基因的變異。RA的基本病理變化時滑膜炎，滑膜增厚，炎性滲出，炎性細(xì)胞浸潤，血管翳生成，

3、軟骨、軟骨下骨侵蝕性破壞，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞，關(guān)節(jié)脫位，關(guān)節(jié)融合。RA的臨床表現(xiàn)為早期多個關(guān)節(jié)的腫脹、慢性疼痛、關(guān)節(jié)僵硬，晚期關(guān)節(jié)癥狀則表現(xiàn)為發(fā)病關(guān)節(jié)的僵硬或強(qiáng)直，關(guān)節(jié)病理性脫位，關(guān)節(jié)畸形改變，關(guān)節(jié)外重要臟器的損害，如心臟、肺臟、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)及眼睛等器官、組織功能減退，功能喪失。高達(dá)10％RA病人患病數(shù)年后關(guān)節(jié)功能喪失，肌肉萎縮，重要臟器功能減退，喪失勞動能力，長期受病痛折磨，嚴(yán)重影響著病人生活質(zhì)量，嚴(yán)重危害人們的身體健康，給家庭、社會帶來

4、巨大負(fù)擔(dān)。而且，RA患者具有較高的死亡率，死亡常見原因?yàn)楦腥竞托难芗膊。渌Ｒ姷乃劳鲈蜻€包括腎臟疾病、胃腸道并發(fā)癥、肺臟疾病。RA病人生存期普遍縮短3-18年。
　　近年來，雖然分子生物學(xué)、免疫學(xué)有了飛速的發(fā)展，世界各地對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制研究取得了不少成就，如研究發(fā)現(xiàn)RA與細(xì)胞因子、Th1/Th2細(xì)胞平衡、淋巴細(xì)胞凋亡有關(guān)，但類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制研究目前沒有突破性進(jìn)展，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前已知

5、的RA發(fā)病的危險因素有:(1)遺傳因素，RA患者一級親屬的患病的幾率較無親屬關(guān)系個體高2-4倍，目前發(fā)現(xiàn)的與遺傳有關(guān)的基因有HLA-DR、PADI4和PTPN22等;(2)激素及生育因素，RA女性發(fā)病率高于男性，男性RA患者，血液中睪酮較非患病人群低，女性妊娠期激素水平變化，RA自發(fā)緩解;(3)其它因素，如營養(yǎng)因素，環(huán)境因素，吸煙，感染或環(huán)境毒素。
　　目前臨床上關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷不斷完善，其中美國風(fēng)濕病學(xué)會關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎

6、的分類及診斷標(biāo)準(zhǔn)具有較高的特異性和敏感性。隨著世界范圍對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎研究的深入，對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的認(rèn)識不斷加深，臨床診斷手段不斷增多，血清學(xué)檢查，除了早期的類風(fēng)濕因子檢查外，RA免疫學(xué)檢查手段增多，如血清中抗聚絲蛋白抗體(AFA)、抗核周因子抗體(APF)、抗角蛋白抗體(AKA)、抗RA-33以及抗P68的檢查，使臨床上RA診斷敏感、特異性更高，使臨床上RA診斷率顯著提高。影像學(xué)檢查從以前的x線平片檢查，發(fā)展到平片、B超、CT、MRI

7、多種檢查相結(jié)合，特別是MRI檢查，可顯示早期滑膜、軟骨改變，對早期RA診斷敏感性最高的無創(chuàng)檢查手段，其特異性、準(zhǔn)確率也高達(dá)80％以上。
　　隨著對RA研究的不斷深入，RA的治療手段不斷增多。(1)藥物治療:非甾體抗炎藥可緩解關(guān)節(jié)的腫痛癥狀;DMARDs可緩解RA病情，可延緩或阻止關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的破壞;合并血管炎和NSAIDs藥物無效的RA病人可小劑量糖皮質(zhì)激素治療，控制癥狀，緩解骨質(zhì)破壞;(2)生物制劑:目前多種生物制劑已應(yīng)用

8、于臨床或處于不同研究階段，如腫瘤壞死因子抑制劑，白細(xì)胞介素抑制劑，cD20單抗(rit—uximab)、T細(xì)胞受體疫苗、HLA-DRB1疫苗、HLA—DR4多肽和Vitaxin等，是針對RA發(fā)病中T細(xì)胞、B細(xì)胞、組織相容抗原、腫瘤壞死因子、炎性介質(zhì)等多個環(huán)節(jié)的靶向治療，可緩解病人臨床癥狀，改善關(guān)節(jié)破壞;(3)干細(xì)胞治療:目前用于治療RA的主要是間充質(zhì)干細(xì)胞，一定程度上克服了上述治療方式中的缺點(diǎn)，具有修復(fù)實(shí)質(zhì)組織器官和免疫調(diào)節(jié)作用;(4)

9、基因治療:通過病毒或非病毒載體將治療基因轉(zhuǎn)染到病變局部，抑制局部病變發(fā)展，抑制軟骨和軟骨下骨破壞，免疫調(diào)節(jié);(5)其它治療方式:如免疫凈化治療等。上述治療方式有其不同的優(yōu)點(diǎn)，也有其明顯的缺點(diǎn)，如抗炎藥物和慢作用抗風(fēng)濕藥，可并發(fā)嚴(yán)重的消化道出血，免疫抑制，病情復(fù)發(fā)率高，不能改變病情進(jìn)展，長時間應(yīng)用激素可導(dǎo)致患者免疫力降低、骨質(zhì)疏松、水鈉儲留等并發(fā)癥，生物制劑靶向特異性差，增加各種手術(shù)后感染的發(fā)生，昂貴，需反復(fù)注射。在RA治療上干細(xì)胞治療尤

10、其明顯的優(yōu)勢，但同時存在許多問題，如強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)，移植細(xì)胞和受體細(xì)胞不能有效整合，疾病傳播，倫理問題，移植效果不穩(wěn)定，干細(xì)胞數(shù)量、質(zhì)量限制，甚至誘導(dǎo)腫瘤形成等一系列問題，限制了干細(xì)胞臨床應(yīng)用。近年來，基因治療發(fā)展很快，基因治療存在導(dǎo)致畸形、基因突變、導(dǎo)致癌變等安全性問題，也存在著基因治療的靶向特異性不高及體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率低的問題，受體免疫反應(yīng)也不容忽視，還有表達(dá)穩(wěn)定性問題，但其從分子水平對RA發(fā)病機(jī)制治療，為RA的治療開辟了的領(lǐng)域。高

11、效安全的基因載體是基因治療發(fā)展的關(guān)鍵問題之一，目前的基因轉(zhuǎn)染的載體分為腺病毒載體、皰疹病毒載體等病毒載體和納米載體等非病毒載體，常用的病毒載體有反轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺相關(guān)病毒載體，皰疹病毒載體，牛痘疫苗病毒載體，腺病毒載體等，非病毒載體主要有配體介導(dǎo)的靶向載體、陽離子高聚物(cationicpolymer)、脂質(zhì)體和脂質(zhì)體復(fù)合物(liposomes or lipoplexes)和裸DNA(nakedDNA)等，其中使用最多的腺相關(guān)病毒載體占

12、目前應(yīng)用載體的20％以上。
　　腺相關(guān)病毒載體載體具有如下優(yōu)點(diǎn):其一是安全性高，目前無野生型腺相關(guān)病毒對人體致病的報道;可廣泛轉(zhuǎn)導(dǎo)到分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞內(nèi);在多種有機(jī)溶劑內(nèi)仍保持生物特性，60攝氏度不能被滅活;宿主有限的弱免疫反應(yīng);體內(nèi)有體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)炎癥關(guān)節(jié)細(xì)胞的傾向，可通過DNA修復(fù)酶預(yù)處理后轉(zhuǎn)導(dǎo)效率增強(qiáng)。為進(jìn)行類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的的實(shí)驗(yàn)研究，目前已建立了多種成熟的動物模型，如膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arth

13、ritis，CIA)、四甲基十五烷誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(pristante induced arthritis，PIA)、佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant induced arthritis，ALA)、多聚糖蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(proteoglycan induced arthritis，PGIA)、DDA誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(dimethyl dioctadecylammonium bromide induced arthritis，DIA)和轉(zhuǎn)基因動物

14、模型等，CIA大鼠模型從1980年英國的Courtenay等首先報道30多年來，不斷研究改進(jìn)，逐漸出現(xiàn)誘導(dǎo)后發(fā)病時間短，成功率高的DBA/1小鼠模型，又因其臨床表現(xiàn)、檢驗(yàn)指標(biāo)和病理機(jī)制上與人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎臨床表現(xiàn)、病理改變、免疫變化近似，成為研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎抗免疫藥物和其它薪藥，以及基因治療和干細(xì)胞移植治療的最為理想的動物模型。
　　在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病情進(jìn)展過程中，破骨細(xì)胞的作用尤其重要。破骨細(xì)胞作為目前發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)唯一的骨吸收細(xì)

15、胞，是骨骼再塑形不可或缺的細(xì)胞，正常情況下，人體內(nèi)破骨和成骨維持動態(tài)平衡，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人體內(nèi)各種炎性介質(zhì)、炎性因子的刺激下，分化、成熟加快，活性增強(qiáng)，造成關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨下骨的不斷破壞、丟失，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形，關(guān)節(jié)失用，如何在不影響其它部位破骨細(xì)胞活性同時，抑制炎癥局部破骨細(xì)胞活性，抑制關(guān)節(jié)炎骨量丟失，起到從發(fā)病機(jī)制上治療RA的目的。OPG是體內(nèi)天然存在的可溶性受體，與RANKL結(jié)合，不伴隨生理信號傳導(dǎo)，在體外抑制破骨細(xì)胞產(chǎn)生，OP

16、G是RANK的拮抗性受體，通過和RANK競爭和RANKL結(jié)合，抑制RNK和RANKL結(jié)合，阻斷生理信號傳導(dǎo)，從而抑制破骨細(xì)胞生成、成熟，抑制了軟骨下骨破壞，同時實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OPG有軟骨保護(hù)作用，可以負(fù)向調(diào)節(jié)部分炎癥因子。對于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎這類慢性破壞性、炎性疾病而言，治療中遇到的最大難題是缺乏長期有效控制炎癥、病情進(jìn)展的藥物，缺乏特異性治療藥物載體，使藥物在體內(nèi)長期維持有效藥物濃度。盡管基因治療還不成熟，存在潛在的風(fēng)險，治療性基因載體顯現(xiàn)

17、出許多優(yōu)勢。病毒或非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染，可以有效地的將治療基因轉(zhuǎn)染到目標(biāo)位置，在局部合成有長期治療作用的蛋白質(zhì)。與其他病毒載體相比，重組腺相關(guān)病毒載體已經(jīng)顯現(xiàn)出許多明顯優(yōu)勢，如可以感染正在分化和非分化的宿主細(xì)胞，且在體內(nèi)僅僅引起有限的宿主免疫反應(yīng)。我們的研究表明，實(shí)驗(yàn)過程中，單次注射AAV-OPG到第一個發(fā)病的小鼠鼠爪關(guān)節(jié)內(nèi)，表現(xiàn)出滿意的治療效果。OPG基因局部轉(zhuǎn)染后，在轉(zhuǎn)染后的關(guān)節(jié)組織內(nèi)持續(xù)至少3周可檢測到基因轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的OPG蛋白，從

18、基因轉(zhuǎn)染治療3周后出現(xiàn)好的治療效果，這種好的治療效果持續(xù)到第8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束。另外，在實(shí)驗(yàn)組小鼠血清和其它器官內(nèi)，外源性基因的表達(dá)沒有檢測到。
　　綜上所述，RA又是一種嚴(yán)重影響全世界大量人口生活質(zhì)量，致殘率、死亡率很高的慢性疾病病，目前治療RA的抗炎、慢性抗風(fēng)濕藥物達(dá)不到治療目的，生物制劑的半衰期短，達(dá)不到穩(wěn)定長期控制關(guān)節(jié)炎發(fā)展的作用，不可避免的出現(xiàn)關(guān)節(jié)嚴(yán)重破壞，喪失功能。作為一種有吸引力的有前景的治療方式，局部的基因轉(zhuǎn)染治療，可以

19、將OPG基因轉(zhuǎn)染到關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)周圍組織，在局部產(chǎn)生有長期，治療作用的OPG蛋白，達(dá)到長期穩(wěn)定治療關(guān)節(jié)炎的目的，保護(hù)、保留關(guān)節(jié)功能。本項(xiàng)研究的目的是檢驗(yàn)腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的OPG基因轉(zhuǎn)染，在膠原相關(guān)關(guān)節(jié)炎小鼠中的可行性和有效性。
　　目的：
　　通過動物實(shí)驗(yàn)用腺相關(guān)病毒載體將OPG轉(zhuǎn)染到關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)局部，治療小鼠CIA:
　　1.檢驗(yàn)腺相關(guān)病毒載體將OPG轉(zhuǎn)染到關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)局部，并有相應(yīng)OPG蛋白質(zhì)表達(dá)的可行性;
　　2.檢

20、驗(yàn)外源性O(shè)PG是否能有效抑制了關(guān)節(jié)炎相關(guān)的軟骨、軟骨下骨的侵蝕性破壞，保護(hù)了關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)的解剖結(jié)構(gòu);
　　3.檢驗(yàn)OPG有無負(fù)向調(diào)節(jié)其它關(guān)節(jié)炎相關(guān)炎性介質(zhì)如gIFN、MMP3和IL-1的作用;
　　4.進(jìn)一步探討類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制。
　　材料和方法：
　　1.動物
　　40只10-12周雌性DBA/1小鼠購自美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室(Jackson Laboratory，BarHarbor, ME，USA)，體重

21、20g以上，飼養(yǎng)在有膠原隔離作用的特制鼠籠內(nèi)，喂以嚙齒類動物食物，每天光照12個小時。所有實(shí)驗(yàn)用小鼠實(shí)驗(yàn)前隔離喂養(yǎng)2周。本研究獲得美國動物調(diào)查委員會批準(zhǔn)。
　　2.重組腺相關(guān)病毒載體制備和純化AAV-OPG-eGFP質(zhì)粒。已純化的rAAV-CMV-OPG-IRES-eGFP用無輔助病毒方法純化和包裝。rAAV-CMV-OPG-IRES-eGFP的滴度為1×109/ml，AAV-LacZ載體購自北卡羅萊納州大學(xué)醫(yī)學(xué)院基因治療中心(G

22、ene Core Facility, Universityof North Carolina, USA)，滴度1×1011/ml。
　　3.小鼠CIA模型的建立及檢測40只雌性10-12周DBA/1小鼠，購自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME，美國)。本地牛Ⅱ型膠原溶解在0.01M的乙酸內(nèi)，濃度2mg/ml，4℃下過夜，等體積福氏完全佐劑乳化，在每只小鼠尾巴根部皮下濃度為0.5mg/ml的Ⅱ型牛膠原1

23、00μg，每周測體重，觀察健康狀況。注射每天觀察實(shí)驗(yàn)鼠，在鼠爪跖趾、或掌指關(guān)節(jié)處出現(xiàn)明顯紅、腫、紅斑視為關(guān)節(jié)炎發(fā)病。本組40只小鼠1-4只爪子在弗氏完全佐劑后3-7周內(nèi)均出現(xiàn)典型關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎臨床表現(xiàn)后隨機(jī)分為3組，治療組(n=16)炎癥關(guān)節(jié)內(nèi)注射滴度為108 cfu/ml AAV-OPG-eGFP，對照組(n=16)炎癥關(guān)節(jié)內(nèi)注射滴度為108cfu/mlAAV-LacZ，陰性對照組(n=8)注入無病毒的培養(yǎng)液。注射方法:

24、無菌操作，漢密爾頓針管，針頭271/2G，與皮膚呈45度較向腕或踝關(guān)節(jié)內(nèi)，關(guān)節(jié)滑膜和關(guān)節(jié)周圍組織都有病毒感染。
　　CIA小鼠每周臨床評估5次，用足爪儀測量（精確度0.01mm，DYER Inc.德國型號:304196）每個足爪厚度，記錄并對比，每周3次，連續(xù)測8周至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。根據(jù)既定的評分方法評分，每只小鼠的最高賦分為12分（4只爪子），表示小鼠關(guān)節(jié)炎疾病發(fā)展到最嚴(yán)重階段。
　　4.取材
　　所有實(shí)驗(yàn)鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病后8

25、周二氧化碳吸入法處死。超潔凈工作臺上切下有所有的爪子，不要超過腕或踝關(guān)節(jié)，剝?nèi)テっ刈ψ诱锌v軸劈開爪子，分為2份，所有右前爪和后爪放到1個玻璃器皿內(nèi)，左側(cè)放到另外一個玻璃器皿內(nèi)，瓶體上標(biāo)記，1份用10％福爾馬林固定，溶液超過組織水平2厘米，進(jìn)行組織學(xué)分析，另1份儲存在-800冰箱內(nèi)，留作分子生物學(xué)分析。
　　5.關(guān)節(jié)炎爪子組織內(nèi)基因轉(zhuǎn)染蛋白表達(dá)的檢測
　　5.1 蛋白提取在小鼠關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)成功，治療組和對照組關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)內(nèi)注射

26、重組AAV-OPG or AAV-LacZ基因轉(zhuǎn)染后第3天，7天，14天，21天，每組每次隨機(jī)取1只小鼠二氧化碳吸入法處死，切下基因轉(zhuǎn)染后的爪子，剪成5-6片，放到15毫升試管內(nèi)，每管內(nèi)加入1毫升組織細(xì)胞裂解液，機(jī)械勻漿機(jī)低速勻漿20秒，再高速勻漿20秒，在4℃下，12000rpm離心15分鐘，收集上清液，轉(zhuǎn)至1.5毫升離心管，Pierce BCA蛋白分析試劑盒，樣品稀釋至40μg/100μl,留作ELISA實(shí)驗(yàn)。
　　5.2 E

27、LISA上述制備好的蛋白樣品，通過ELISA試劑盒檢測轉(zhuǎn)染后關(guān)節(jié)組織內(nèi)OPG蛋白含量。加0.5mg/ml已經(jīng)純化的OPG抗體20μl到0.1M NaHCO35ml中稀釋至濃度為2μ g/ml。96孔盤每孔加50μ l的上述溶液鋪板，放置于4℃冰箱孵育過夜;棄掉盤內(nèi)溶液后，在紙巾上反復(fù)輕拍，徹底移除原液，并用含0.05％ Tween-20的PBS反復(fù)沖洗5次;每孔添加200ul的5％脫脂奶粉封閉液，室溫下放置4小時;濃度為1μ g/ml標(biāo)

28、準(zhǔn)蛋白，依次稀釋，獲得所需梯度標(biāo)準(zhǔn)液。96孔盤在紙巾上反復(fù)輕拍甩凈溶液后，TPBS反復(fù)沖洗6次，分標(biāo)準(zhǔn)蛋白、檢測樣品PBS空白對照組各50μ l，加入相應(yīng)的孔中，4℃冰箱孵育過夜。用PBS沈盤6次后，濃度0.5mg/ml的biotin anti-OPG20μl加入10ml5％牛奶/PBS中，稀釋成1mg/ml，每孔加入100μ l，37℃恒溫箱孵育1小時，然后TPBS洗6次。20μ l辣根過氧化酶(HRP)用10ml的PBS稀釋，然后每

29、孔加入100μ l，室溫下放置40分鐘，TPBS反復(fù)沖洗6次。每孔加入即時配制50μ lOPD顯色液（substrate reagent A， substrate reagent B，各15ml混勻，避光反應(yīng)30分鐘，孔內(nèi)溶液逐漸變?yōu)樗{(lán)色。然后，加入1M H2SO4100μ l/孔終止反應(yīng)。緊接著用酶標(biāo)儀測450nm處OD值，選“l(fā)og-log”做出標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)在同一ELISA盤子樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線對比推算轉(zhuǎn)染蛋白水平。
　　6.組織

30、學(xué)分析
　　6.1 制備組織切片前述去除皮、毛的鼠爪，已用10％福爾馬林固定2天以上，倒掉福爾馬林，流水沖洗，浸泡到12％EDTA中，直至組織軟化為止;取出鼠爪，流水沖洗，依次用70％酒精、90％酒精、95％酒精、無水酒精、無水酒精脫水處理;透明處理，然后將透明化的樣品依次進(jìn)行純蠟置換:1∶2純蠟、二甲苯，1∶1純蠟、二甲苯，然后2∶1的純蠟、二甲苯，100％純蠟，再次100％純蠟30分鐘;熔化后的純蠟加入包埋框中，待石蠟硬化后取

31、出蠟塊;與爪子長軸平行切片，用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)將標(biāo)本切成厚6μ m的不間斷切片。放到烤片機(jī)內(nèi)60℃下烘干40分鐘。
　　6.2 H&E染色切片以100％二甲苯脫蠟，然后無水乙醇漂洗，不同濃度依次酒精浸泡， PBS和蒸餾水漂洗;切片從蒸餾水中轉(zhuǎn)至Harris蘇木素染色，迅速鏡檢觀察到細(xì)胞核及核內(nèi)染色體清晰為止，流水沖洗玻片上的殘留染液，然蒸餾水沖洗;0.5％伊紅染液染色，依次用不同濃度酒精脫水，浸入二甲苯中透明，滴加中性樹膠，加蓋玻片封片

32、;
　　6.3 甲苯胺藍(lán)染色(Toluidine blue) H&E染色的切片，用甲苯胺藍(lán)反應(yīng)液染色2-3分鐘，蒸餾水沖洗95％酒精、100％×2次快速脫水，二甲苯透明化處理，封片，藍(lán)色背景，軟骨細(xì)胞紫紅色。甲苯胺藍(lán)染色評價關(guān)節(jié)軟骨破壞程度。用既定的關(guān)節(jié)炎組織病變嚴(yán)重程度分級方法，分析H&E和甲苯胺染色后的切片。
　　6.4 X-gal染色新鮮冰凍LacZ轉(zhuǎn)染后鼠爪，用40C福爾馬林固定10分鐘，3xPBS沖洗5分鐘，蒸餾水

33、沖洗，鼠爪浸泡到X-gal反應(yīng)液中，370恒溫恒濕孵育箱內(nèi)24小時，取出后用蒸餾水沖洗，核固紅復(fù)染3-5分鐘，蒸餾水沖洗。大體觀察標(biāo)本，轉(zhuǎn)染成功組織標(biāo)本和細(xì)胞核分別呈藍(lán)色和粉紅色。
　　7.MicroCT骨密度檢測在整個實(shí)驗(yàn)過程中，用MicroCT檢測關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)骨密度變化。小鼠用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉后MicroCT掃描，掃描參數(shù)設(shè)定為45μm isotropic voxel size，400projections,曝光時間400

34、ms，電壓80 KW, and電流450μA，三維重建掃描部位，GEHC MicroView(@)1.0軟件分析，取2，3，4跖值關(guān)節(jié)表面遠(yuǎn)近3mm作為目標(biāo)范圍，測出體積，進(jìn)而計算出軟骨下骨骨密度。分析過程中，所有標(biāo)本閾值設(shè)定排除軟組織影響。
　　8.RT-PCR檢測基因表達(dá)取材過程同前，取治療組和對照組劈開鼠爪，無菌操作，將每個鼠爪切成5-6片，每管加入3毫升RNAzol，機(jī)械勻漿機(jī)低速勻漿，離心10分鐘，上清液（約1.2毫升）

35、轉(zhuǎn)至1.5毫升離心管內(nèi)，每管加入240ul氯仿，劇烈震蕩20秒，放到冰浴5分鐘，4℃12000g離心15分鐘，上清液（約650ul）轉(zhuǎn)移至新的離心管內(nèi)，加入等量的異丙醇，混勻，-200C冰箱過夜，第二天取出，4℃12000g離心15分鐘，棄掉上清液，每管加入75％酒精，4℃7500g離心8分鐘，倒掉上清液，室溫下干燥20分鐘。RNA稀釋，加樣，選擇相對CT定量分析方法，40分鐘快速升溫循環(huán)制作cDNA后，標(biāo)準(zhǔn)升溫相對CT定量分析方法檢測

36、oPG、LacZ蛋白水平，同時檢測IL-1，TNF，IL-6，MMP3，TRAP和IFN-λ炎癥前因子、炎性介質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的水平變化。
　　結(jié)果：
　　1.基因轉(zhuǎn)染蛋白表達(dá)用ELISA方法定量分析局部基因轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)，結(jié)果表明OPG基因轉(zhuǎn)染后的CIA小鼠爪子勻漿內(nèi)，人OPG蛋白從轉(zhuǎn)染后第三天起就處于較高水平，每毫克總蛋白內(nèi)含約540pg人OPG蛋白，持續(xù)到21天，人OPG蛋白水平為80pg/mg，高峰期出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后7天，

37、同時OPG蛋白水平在小鼠血清中的水平非常低，說明OPG基因轉(zhuǎn)染局部作用明顯，對全身影響比較小。AAV-lacZ載體注射組鼠爪X-gal染色后鼠爪關(guān)節(jié)組織呈現(xiàn)以往文獻(xiàn)描述的典型的藍(lán)色，細(xì)胞核粉紅色，而沒有注射AAV-lacZ載體的鼠爪和注射AAV-lacZ載體后的小鼠關(guān)節(jié)以外的組織、器官X-gal染色后沒有出現(xiàn)陽性反應(yīng)。
　　2.OPG基因轉(zhuǎn)染對CIA小鼠病情發(fā)展的影響小鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病，關(guān)節(jié)內(nèi)注射治療性O(shè)PG基因后，最快從3周起，到觀

38、察到第8周結(jié)束，OPG基因轉(zhuǎn)染治療明顯緩解治療組小鼠關(guān)節(jié)炎病情。與對照組相比，OPG基因轉(zhuǎn)染后觀察期內(nèi)每只小鼠發(fā)生關(guān)節(jié)炎的爪子的數(shù)目明顯降低了，而且觀察期內(nèi)從小鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎開始臨床評分，治療組小鼠關(guān)節(jié)炎平均分明顯低于對照組平均分。
　　3.組織學(xué)分析H&E染色陰性對照組和LacZ基因轉(zhuǎn)染對照組組織學(xué)切片中，可見重度的滑膜炎癥細(xì)胞浸潤，血管翳生成等炎癥表現(xiàn)，明顯的軟骨下骨和軟骨破壞，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)畸形改變;體內(nèi)轉(zhuǎn)染OPG基因的治療組組織切

39、片和對照組小鼠關(guān)節(jié)組織炎癥相比，治療組小鼠關(guān)節(jié)組織炎癥組織學(xué)評分并沒有明顯降低，但治療組小鼠關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨破壞顯著減輕。甲苯胺藍(lán)染色組織學(xué)切片中，軟骨細(xì)胞呈紫紅色，OPG基因轉(zhuǎn)染治療組小鼠關(guān)節(jié)軟骨無明顯侵蝕性破壞，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)、關(guān)節(jié)間隙無明顯變化。
　　4.關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)骨密度改變通過MicroCT掃描重建各組小鼠目標(biāo)關(guān)節(jié)，選定關(guān)節(jié)面遠(yuǎn)近3mm骨骼作為目標(biāo)區(qū)域，定量測定軟骨下骨骨密度，與對照組和陰性對照組相比，OPG基因治療組小鼠軟骨

40、下骨骨密度減低幅度明顯降低，接近無關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨下骨骨密度。
　　5.RT-PCR分析RT-PCR數(shù)據(jù)說明，與對照組相比，OPG基因轉(zhuǎn)染組小鼠鼠爪內(nèi)TRAP, RANK，MMP3，和INFγ的信使RNA的表達(dá)明顯降低，對照組和治療組相比TNF和IL-6的mRNA在鼠爪局部的表達(dá)無明顯差異，IL-1的mRAN表達(dá)有降低趨勢。
　　結(jié)論：
　　1.腺相關(guān)病毒載體成功將OPG轉(zhuǎn)染到關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)，并有相應(yīng)OPG蛋白質(zhì)表達(dá);OPG