基于葡萄糖測(cè)定的電化學(xué)免疫分析方法的建立及其初步評(píng)價(jià).pdf

1、背景：生物標(biāo)志物是存在于血液、其他體液中，反映正?；虍惓＝M織生理或疾病狀態(tài)下的生物分子，可用于亞臨床疾病的早期檢測(cè)、急慢性綜合征的診斷、危險(xiǎn)因素分層、疾病進(jìn)展的監(jiān)測(cè)及診療選擇和/或療效評(píng)估等方面。大規(guī)模人類蛋白質(zhì)組比較研究表明，從健康到疾病的進(jìn)展過(guò)程中往往伴隨著循環(huán)系統(tǒng)和/或受累組織中蛋白表達(dá)的復(fù)雜改變。常規(guī)蛋白類生物標(biāo)志物的檢測(cè)采用的是免疫測(cè)定法，其中，早期應(yīng)用最為普遍的免疫測(cè)定方法是酶聯(lián)免疫吸附法。然而，對(duì)于某些出現(xiàn)緊急情況（如，胸

2、痛、呼吸困難或其他嚴(yán)重醫(yī)療情況以及外傷患者）的患者來(lái)說(shuō)，開(kāi)發(fā)便攜式、成本低的定量檢測(cè)蛋白類生物標(biāo)志物的方法具有重要意義。床旁檢測(cè)(POCT)是一種利用便攜式分析儀和快速診斷試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)的方法，這種方法的所有檢測(cè)可在醫(yī)院檢驗(yàn)科或臨床實(shí)驗(yàn)中心等實(shí)驗(yàn)室以外的地方進(jìn)行。調(diào)查結(jié)果顯示，臨床上急需發(fā)展這種檢測(cè)方法。POCT為日益微型化的儀器設(shè)備和程序提供了便利，其主要優(yōu)勢(shì)在于不需要將標(biāo)本送至實(shí)驗(yàn)室，也不需要經(jīng)標(biāo)本的前處理，且可獲得快速的床旁檢

3、測(cè)結(jié)果，這種時(shí)間上的優(yōu)勢(shì)為緊急診斷和治療提供了便利。免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)、生物芯片和生物傳感器技術(shù)是POCT的三大理論基礎(chǔ)。在免疫測(cè)定領(lǐng)域，POCT的最佳應(yīng)用是心肌損傷指標(biāo)的檢測(cè)，因?yàn)橛幸话氲男赝椿颊弑仨毥柚鍖W(xué)指標(biāo)檢測(cè)才可獲得早期確診，試劑主要采用膠體金免疫層析試條。生物傳感器領(lǐng)域最成熟的POCT檢測(cè)設(shè)備為便攜式血糖儀的應(yīng)用，其出現(xiàn)一方面是出于糖尿病患者家庭護(hù)理的需要，另一個(gè)重要的原因是由于生物傳感技術(shù)及絲網(wǎng)印刷技術(shù)的進(jìn)步，從而使這種

4、檢測(cè)設(shè)備應(yīng)運(yùn)而生。生物傳感器作為一門涉及化學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)以及電子學(xué)等領(lǐng)域的交叉學(xué)科，且集高效、靈敏、特異、小巧、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)于一身，目前已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。它利用各種類型的換能器，將待測(cè)的生物信號(hào)轉(zhuǎn)換為電、聲、光等可檢測(cè)的物理信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中靶生物分子的檢測(cè)。用于生物傳感器的檢測(cè)技術(shù)包括熒光技術(shù)、石英晶體微天平、電化學(xué)發(fā)光、表面等離子共振光譜和電化學(xué)方法等。在這些方法中，電化學(xué)方法因受環(huán)境干擾少、信號(hào)檢測(cè)簡(jiǎn)單、儀器成本

5、低等優(yōu)點(diǎn)而引起了人們的廣泛關(guān)注。葡萄糖傳感器是電化學(xué)生物傳感器領(lǐng)域研究最多、商品化最早的生物傳感器。葡萄糖生物傳感器的發(fā)展主要基于兩方面的技術(shù)基礎(chǔ):第一，葡萄糖是動(dòng)植物體內(nèi)碳水化合物的重要組成部分，葡萄糖的定量測(cè)定在生物化學(xué)、臨床化學(xué)和食品分析中都占有很重要的位置，其分析方法的研究一直引起人們的關(guān)注，特別是臨床檢驗(yàn)中對(duì)血糖分析的需求，促進(jìn)了葡萄糖酶分析方法的建立;第二，1954年，Clark建立了氧電極分析方法。1956年又對(duì)極譜式氧電

6、極進(jìn)行了重大改進(jìn)，使活體組織氧分壓的無(wú)損測(cè)量成為可能，并首次提出了氧電極與酶的電化學(xué)反應(yīng)理論。根據(jù)Clark電極理論，自20世紀(jì)60年代開(kāi)始，各國(guó)科學(xué)家紛紛開(kāi)始葡萄糖傳感器的研究。經(jīng)過(guò)半個(gè)世紀(jì)的努力，葡萄糖傳感器的研究和應(yīng)用已有了很大的發(fā)展，在食品分析、發(fā)酵控制、臨床檢驗(yàn)等方面發(fā)揮著重要的作用。自1994年絲網(wǎng)印刷傳感器用于葡萄糖的監(jiān)測(cè)的商業(yè)化生產(chǎn)以來(lái)，在過(guò)去的19年里大約有10家公司致力于這種儀器及葡萄糖試紙的制造和市場(chǎng)營(yíng)銷，隨著微電

7、子工業(yè)的快速發(fā)展，使血糖儀不斷朝著多功能化、便攜、操作簡(jiǎn)單、成本低的方向發(fā)展。目前，市售的便攜式血糖儀只需1μL標(biāo)本，5秒就能完成檢測(cè)，這種標(biāo)本用量少的快速方法正是臨床檢測(cè)所需要的。
　　 目的：結(jié)合蛋白類生物標(biāo)志物檢測(cè)的需要及便攜式血糖儀的檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)，以如何將便攜式血糖儀與經(jīng)典的酶聯(lián)免疫法相結(jié)合用于蛋白類生物標(biāo)志物的檢測(cè)為主要研究?jī)?nèi)容，將糖化酶(glucoamylase)作為葡萄糖和蛋白類生物標(biāo)志物之間重要的連接物，初步建立一種

8、基于葡萄糖檢測(cè)的電化學(xué)免疫分析方法，為利用便攜式血糖儀進(jìn)行蛋白類生物標(biāo)志物的POCT檢測(cè)提供新思路。
　　 方法：⑴檢測(cè)體系的構(gòu)建:以甲胎蛋白作為模型分析物，免疫反應(yīng)在商品化的酶標(biāo)板中進(jìn)行，采用夾心免疫模式，將AuNPs標(biāo)記的生物標(biāo)記物Ab2/glucoamylase/AuNPs作為酶標(biāo)抗體。酶標(biāo)抗體通過(guò)將抗-甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)抗體和糖化酶加入AuNPs溶液中，將糖化酶和抗-AFP同時(shí)標(biāo)記到該

9、納米粒子表面，制備得到Ab2/glucoamylase/AuNPs生物標(biāo)記物。夾心免疫反應(yīng)后，向酶標(biāo)板中加入淀粉，在AFP存在的條件下，結(jié)合在酶標(biāo)板上的免疫復(fù)合物中的糖化酶水解底物淀粉，產(chǎn)生葡萄糖。將上述溶液加入絲網(wǎng)印刷電極上檢測(cè)，葡萄糖傳感器的制備是通過(guò)將葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，GOD)和電子媒介體K3[Fe(CN)6]加入待測(cè)液中，利用葡萄糖傳感器測(cè)定夾心免疫復(fù)合物中糖化酶催化淀粉產(chǎn)生的葡萄糖的量，進(jìn)而通過(guò)葡萄糖

10、的檢測(cè)對(duì)免疫分析物進(jìn)行定量檢測(cè)。⑵實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化:對(duì)制備二抗探針的pH值、Ab2與糖化酶比例及二抗孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。⑶二抗探針的表征及該方法的性能評(píng)價(jià):二抗探針進(jìn)行透射電鏡掃描，觀察標(biāo)記前后納米粒子的結(jié)構(gòu)性質(zhì);利用紫外-可見(jiàn)吸收光譜對(duì)標(biāo)記過(guò)程進(jìn)行表征。對(duì)該方法的線性范圍、特異性及重復(fù)性等性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。⑷底物的預(yù)處理及其處理?xiàng)l件的優(yōu)化:配制20 mg mL-1的淀粉溶液，加熱煮沸30分鐘制成糊化淀粉，在加至酶標(biāo)板之前，往溶液中加入耐熱α-

11、淀粉酶制成液化淀粉。在已建立的葡萄糖-電化學(xué)免疫分析法的基礎(chǔ)上，通過(guò)耐熱α-淀粉酶和糖化酶雙酶水解的方法提高糖化酶水解淀粉的速率，最終實(shí)現(xiàn)以便攜式血糖儀作為檢測(cè)設(shè)備的目標(biāo)。研究糖化酶水解淀粉的最佳液化溫度、液化時(shí)間、底物濃度、糖化溫度、pH值。⑸糖化酶與葡萄糖之間線性關(guān)系的研究:配制不同濃度糖化酶，往淀粉溶液中加入各不同濃度糖化酶，用血糖儀檢測(cè)水解產(chǎn)生的葡萄糖的量。⑹檢測(cè)方法:以甲胎蛋白作為目標(biāo)檢測(cè)物，在商品化的酶標(biāo)板中進(jìn)行免疫反應(yīng)，采

12、用雙抗夾心ELISA法，檢測(cè)抗體為通過(guò)戊二醛交聯(lián)法制備的糖化酶標(biāo)記抗體;往酶標(biāo)板中加入液化淀粉后，在耐熱α-淀粉酶和糖化酶的協(xié)同水解作用下產(chǎn)生葡萄糖;利用血糖儀檢測(cè)由糖化酶水解產(chǎn)生的葡萄糖的含量，最終通過(guò)葡萄糖的量計(jì)算出待測(cè)物質(zhì)AFP的濃度。⑺對(duì)該方法的線性范圍、抗干擾及血糖儀重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)果：①利用透射電鏡對(duì)納米金及其標(biāo)記蛋白后的納米金生物標(biāo)記物進(jìn)行表征，納米金的大小約50nm，標(biāo)記蛋白后，在納米金的周圍可見(jiàn)一層電

13、子密度較低的陰影。同時(shí)，還通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色和紫外-可見(jiàn)光譜對(duì)標(biāo)記過(guò)程進(jìn)行表征，結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)設(shè)想。②以AFP作為模型分析物，成功構(gòu)建了基于葡萄糖檢測(cè)的電化學(xué)免疫分析方法。該方法的檢測(cè)信號(hào)——葡萄糖的濃度，與檢測(cè)物質(zhì)的濃度相關(guān)，隨著AFP濃度的增加，得到的葡萄糖的濃度越大，在0.5-100 ng mL-1范圍內(nèi)AFP具有良好的檢測(cè)線性。③由于納米金的信號(hào)放大作用，提高了該免疫分析方法的靈敏度，且AuNPs/anti-AFP可批量制備，直接

14、在酶標(biāo)板內(nèi)形成夾心免疫復(fù)合物，無(wú)需復(fù)雜的電極修飾過(guò)程，有望應(yīng)用于臨床腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)。④糖化酶直接水解淀粉反應(yīng)產(chǎn)生的葡萄糖的量與糖化酶的濃度在10 ngmL-1-0.125μg mL-1范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。⑤用血糖儀檢測(cè)同一濃度的葡萄糖溶液，同一批次血糖試紙的CV為2.0％，不同批次之間血糖試紙的CV為3.4％，表明血糖試紙的重復(fù)性較理想。⑥AFP濃度為0.1～100 ng mL-1時(shí)，血糖儀檢測(cè)到的葡萄糖的量與AFP的濃度呈線性關(guān)系。<

15、br>　　 結(jié)論：⑴采用糖化酶作為檢測(cè)抗體的酶標(biāo)記物，將蛋白類生物標(biāo)志物的檢測(cè)通過(guò)經(jīng)典的酶聯(lián)免疫法與葡萄糖濃度的檢測(cè)聯(lián)系起來(lái)，成功構(gòu)建了基于葡萄糖檢測(cè)的電化學(xué)免疫分析方法，有望為臨床上檢測(cè)蛋白類生物標(biāo)志物提供新的檢測(cè)方法。本研究成果為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)傳感器檢測(cè)系統(tǒng)的產(chǎn)品化展示了廣闊的應(yīng)用前景。⑵通過(guò)對(duì)淀粉進(jìn)行預(yù)處理后，提高了糖化酶水解淀粉的效率，并驗(yàn)證了糖化酶水解淀粉產(chǎn)生的葡萄糖的量與糖化酶的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。將預(yù)處理后的淀粉作為