心臟多巴胺D5受體通過氧化應(yīng)激和PKg-ERK1-2-AKT在擴(kuò)張型心肌病發(fā)病機(jī)制中的研究.pdf

1、第一部心臟多巴胺D5受體通過氧化應(yīng)激和PKG-ERK1/2/AKT在擴(kuò)張型心肌病發(fā)病機(jī)制中的研究
　　擴(kuò)張型心肌病(Dilated cardiomyopathy，DCM)是一種以心腔擴(kuò)大、心肌收縮功能障礙為主要特征的進(jìn)行性心肌疾病，但是它的形成機(jī)制到現(xiàn)在尚未完全清楚。前期研究發(fā)現(xiàn)多巴胺D5受體基因敲除(D5-/-小鼠)小鼠血壓明顯升高，心臟重量增加、心肌肥厚;全身表達(dá)D5突變基因D5F173L(CMV-D5F173L)基因的轉(zhuǎn)基因

2、小鼠，自3月齡開始血壓升高，4月齡開始左心室肥大，均顯示多巴胺D5基因與心肌病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其調(diào)控機(jī)制并不清楚。因此我們建立了心臟特異表達(dá)D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠，該小鼠表現(xiàn)出典型的擴(kuò)張型心肌病表型。為此，本課題擬利用心臟特異表達(dá)D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠，以及D5受體基因轉(zhuǎn)染的H9C2細(xì)胞，探討多巴胺D5受體在擴(kuò)張型心肌病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。
　　方法:
　　利用已經(jīng)建立的3月齡心臟特異表達(dá)人多巴胺D5受體突變基因

3、F173L(α-MHC-hD5F173L)和正常基因(α-MHC-hD5WT)轉(zhuǎn)基因小鼠，首先檢測比較轉(zhuǎn)基因小鼠心臟內(nèi)ROS的產(chǎn)量和NOX2的表達(dá)量。然后對α-MHC-hD5F173L小鼠通過腹腔注射NADPH氧化酶的抑制劑羅布麻寧(Apocynin)4周，同時(shí)給PBS作為對照組，然后檢測各項(xiàng)心肌病相關(guān)指標(biāo)。同時(shí)構(gòu)建轉(zhuǎn)染人多巴胺D5受體突變基因(hD5F173L)和正常多巴胺D5受體基因(hD5WT)大鼠心肌細(xì)胞(H9C2)，檢測兩者在

4、基礎(chǔ)條件下ROS產(chǎn)量的變化。為了驗(yàn)證PKA或PKG是否參與到調(diào)節(jié)通路中，我們分別以蛋白酶A抑制劑H89、蛋白酶G抑制劑KT5823刺激，檢測其ROS的產(chǎn)量、NOX2以及絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2的表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　α-MHC-hD5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠的NADPH氧化酶的活性和NOX2以及絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2蛋白的表達(dá)量均明顯高于野生型α-MHC-hD5W

5、T小鼠。羅布麻寧(Apocynin)能顯著減少α-MHC-hD5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠的上述各項(xiàng)指標(biāo)。H9C2-hD5F173L大鼠細(xì)胞系NOX2以及絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2蛋白的表達(dá)量亦高于H9C2-hD5WT對照細(xì)胞。PKG抑制劑KT5823則使得大鼠細(xì)胞系NOX2以及絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2蛋白的表達(dá)量增加，而PKA抑制劑H89對受試細(xì)胞則無明顯作用。
　　結(jié)論:

6、r>　　多巴胺D5受體可能通過PKG途徑調(diào)節(jié)ERK1/2和/或AKT的表達(dá)量，從而引起的活性氧(ROS)產(chǎn)量改變，進(jìn)而影響擴(kuò)張型心肌病的發(fā)生發(fā)展。但是，其具體的作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。
　　第二部血小板NHE-1在鹽敏感性高血壓發(fā)病機(jī)理研究
　　高血壓是一種由多基因、環(huán)境等多種因素引起的復(fù)雜慢性疾病。高血壓分為原發(fā)性高血壓和繼發(fā)性高血壓兩種，其中90％-95％的高血壓為原發(fā)性高血壓。鹽敏感性高血壓是原發(fā)性高血壓的一種特殊

7、類型，鹽的攝入在其發(fā)展中扮演著關(guān)鍵的角色，但鹽如何參與其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制仍不十分清楚，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，血小板介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要影響因素。人體研究報(bào)道，鹽敏感高性血壓人群作為血小板活化的重要標(biāo)志物P-選擇素的含量增加。通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鹽敏感高血壓大鼠高鹽喂養(yǎng)后，血壓升高，血小板功能異常，血小板內(nèi)鈣離子濃度增加，因此，我們假設(shè):對于鹽敏感性高血壓個(gè)體，高鹽誘導(dǎo)血小板表面鈉氫離子泵活化，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，導(dǎo)致血

8、小板活化從而引起炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致血壓的升高。
　　本實(shí)驗(yàn)通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)檢測高鹽負(fù)荷后Dah1鹽敏感大鼠及對照大鼠血小板表面的NHE-1表達(dá)量、血小板活化及炎癥反應(yīng)情況，以期探索血小板表面NHE-1在鹽敏感性高血壓發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法:
　　本研究從在體和離體實(shí)驗(yàn)兩方面對血小板表面的NHE-1在鹽敏感性高血壓發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行探討。
　　1.在體實(shí)驗(yàn):Dah1鹽敏感性高血壓大鼠及其對照組鹽耐受大鼠高

9、鹽(8％NaCl)和低鹽(0.12％NaCl)喂養(yǎng)四周后，測定Dah1大鼠及其對照組的血壓。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板活化率、血小板內(nèi)鈣離子濃度以及血小板表面的鈉氫交換體1(NHE-1)的表達(dá)量;免疫印跡法檢測腎臟多種炎癥因子(IL-6、IL-1、NFκB)的表達(dá)量。
　　2.離體實(shí)驗(yàn):將富集后的SD大鼠血小板血漿，分為對照組、高鹽組、高鹽給藥組，給予不同鹽濃度(0.9％ NaCl，1.3％NaCl)刺激30分鐘后，高鹽給藥組再給N

10、HE-1抑制劑HOE642預(yù)刺激15min，檢測血小板活化率、血小板內(nèi)鈣離子濃度、NHE-1的表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　在體實(shí)驗(yàn):高鹽喂養(yǎng)四周后，Dah1鹽敏感大鼠的血壓較對照組鹽耐受性大鼠顯著升高(P＜0.05)，同時(shí)，血小板活化率顯著上升(P＜0.05)，血小板胞漿內(nèi)鈣離子濃度明顯升高(P＜0.05)，血小板表面NHE-1表達(dá)量增加(P＜0.05)。
　　離體實(shí)驗(yàn):高鹽組血小板活化率、血小板鈣離子濃度及NHE-1的