姜黃素及其衍生物在AD細胞模型中的神經(jīng)保護作用.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's diseas，AD)是一種以進行性認知功能障礙和記憶損害為特征的神經(jīng)退行性疾病。Hardy和Higgins提出的“Aβ學(xué)說”即“淀粉樣蛋白級聯(lián)學(xué)說”認為，Aβ凝集和聚積是AD病理發(fā)生、發(fā)展的起始因素，起始了AD的病理級聯(lián)反應(yīng)，并最終導(dǎo)致了AD所有病理變化和臨床癥狀。因此，對抗Aβ的形成和沉積及毒性作用成為治療AD的根本策略。 微管相關(guān)蛋白2(Microtubule—associated pr

2、otein2，MAP—2)是一種高度保守的蛋白，屬于結(jié)構(gòu)性微管相關(guān)蛋白家族，是腦組織中分布最為豐富的熱穩(wěn)定的磷蛋白，MAP—2主要在神經(jīng)元胞體、樹突、樹突棘和突觸后致密區(qū)表達。MAP—2由單個基因編碼，通過選擇性剪切形成多種轉(zhuǎn)錄子和亞型，根據(jù)分子量不同可以將MAP—2分為不同的亞型，包括高分子質(zhì)量的MAP—2a(280-300 KD)和MAP—2b(270-280 KD)、低分子質(zhì)量的MAP—2c(70 KD)和MAP—2d(75 KD

3、)。MAP—2與神經(jīng)元發(fā)育過程中的構(gòu)型、穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)完整性、維持神經(jīng)細胞正常功能密切相關(guān)。研究顯示，阿爾茨海默病中出現(xiàn)的功能變化與細胞骨架成分異常、微管相關(guān)的運輸障礙、MAP—2依賴的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整性異常有關(guān)。 姜黃素是從植物姜黃中提取的單體，有重要的經(jīng)濟價值和廣泛的藥理作用，具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗HIV-1整合酶等作用。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過多種途徑發(fā)揮抗Alzheimer's disease作用：姜黃素能阻止Aβ與

4、凝血第十因子結(jié)合形成的在AD細胞病理學(xué)起重要作用過氧(化)物酶；能與Cu2+或Fe2+的結(jié)合不僅能夠阻止金屬離子誘導(dǎo)的Aβ聚集和毒性，并通過阻止金屬離子誘導(dǎo)的NF—κB來抑制炎癥損傷；能增強AD患者巨噬細胞吞噬Aβ能力，從而增加老年斑的清除能力；能通過血腦屏障，并特異性的與老年斑結(jié)合，下調(diào)Aβ的水平并部分逆轉(zhuǎn)神經(jīng)炎癥；能有限但有效地逆轉(zhuǎn)營養(yǎng)不良樹突的結(jié)構(gòu)改變。姜黃素是Aβ的強抑制劑，可明顯抑制Aβ的產(chǎn)生與聚集；其他一些姜黃素衍生物對Aβ

5、的產(chǎn)生和聚集也表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，提示姜黃素及其衍生物抑制Aβ的產(chǎn)生與聚集可能與它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)或活性基團有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)均使姜黃素極具開發(fā)成AD防治藥物的價值。 SK—NSH細胞系是由J.L．Biedler建立的人源神經(jīng)母細胞瘤細胞系，SK—N SH細胞可高水平分泌多巴胺—β—羥化酶。一般認為該細胞系具交感神經(jīng)的特性，在β淀粉樣蛋白(Aβ)肽處理后表現(xiàn)出許多與神經(jīng)細胞分化有關(guān)成分的改變等特點，故常用于有關(guān)神經(jīng)細胞分化和功能

6、研究的細胞模型，也是細胞毒性檢測的理想細胞系?；赟K—N SH細胞以上這些特點，本研究采用SK—N SH細胞系經(jīng)Aβ42誘導(dǎo)建立AD細胞模型。 目的： 本研究用SK—N SH細胞系經(jīng)Aβ42誘導(dǎo)建立阿爾茨海默病的細胞模型，用化學(xué)合成法合成單體姜黃素及其六種衍生物D22、D44、D66、D88、DC、IZ，探討姜黃素及其衍生物對Aβ?lián)p傷SK—N SH細胞的神經(jīng)保護作用，從細胞形態(tài)、功能和蛋白表達水平的變化，篩選姜黃素及其

7、衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有神經(jīng)保護作用的活性部位和活性基團，為開發(fā)與研制有效治療阿爾茨海默病的理想藥物提供實驗依據(jù)。 方法： (1)體外SK—N SH細胞培養(yǎng)。復(fù)蘇凍存的SK—N SH細胞，每隔三天半量換液。 (2)化學(xué)合成法合成姜黃素及其衍生物。用化學(xué)合成法合成姜黃素及其六種衍生物D22、D44、D66、D88、DC、IZ。 (3)建立Aβ42誘導(dǎo)的AD細胞模型。將Aβ421mg溶解于1ml PBS中，置于

8、37℃恒溫箱內(nèi)孵育4-7d進行老化處理，然后4℃儲存，用時稀釋。SK—N SH細胞培養(yǎng)3天后，加入不同濃度的經(jīng)老化處理的Aβ42(40、20、10、5、2.5g/ml)繼續(xù)培養(yǎng)24h。 (4) MTT法檢測SK—N SH細胞活性。根據(jù)不同濃度Aβ42(40、20、10、5、2.5μg/ml)對SK—N SH細胞活性的影響繪制劑量效應(yīng)曲線，從中選出10μg/mlAβ42組來構(gòu)建AD細胞模型，并用于后續(xù)實驗。 (5)篩選姜黃

9、素及其衍生物的神經(jīng)保護作用。在AD細胞模型組分別加入相同濃度(10μg/ml)的姜黃素及其六種衍生物D22、D44、D66、D88、DC、IZ，培養(yǎng)24h后用MTT檢測細胞活性。根據(jù)檢測結(jié)果篩選出姜黃素及其衍生物D22(二去甲氧基姜黃素)具有最強的神經(jīng)保護作用，將二者用于后續(xù)實驗。 (6) MAP—2免疫熒光和Hoechst33258熒光染色。分別在Aβ42損傷前、后和姜黃素治療前、后，檢測細胞骨架成分微管相關(guān)蛋白2(MAP—2

10、)和細胞核的改變。 (7)用Western blot檢測在Aβ42損傷前、后和姜黃素治療前、后細胞內(nèi)MAP—2蛋白表達水平的變化。 結(jié)果： (1)用化學(xué)合成法合成的姜黃素及其六種衍生物(D22、D44、D66、D88、DC、IZ)經(jīng)質(zhì)譜、核磁共振譜檢測，鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確無誤。 (2)不同濃度Aβ42(40、20、10、5、2.5μg/ml)加入SK—N SH細胞培養(yǎng)24h后，其細胞存活率分別下降為正常組

11、的18.53％、36.73％、60.99％、79.40％、95.34％。 (3)向AD細胞模型組分別加入10μg/ml的姜黃素及其六種衍生物D22、D44、D66、D88、DC、IZ后，篩選出姜黃素和D22具有最強的細胞保護作用，二者分別使SK—N SH細胞存活率上升23.3％、33.5％。D22對抗Aβ42的損傷作用強于姜黃素；兩側(cè)苯環(huán)被甲呋喃基取代的IZ和去掉了苯環(huán)上4位羥基的姜黃素衍生物，均失去了對抗Aβ42的損傷作用。

12、 (4) MAP-2免疫熒光染色及Hoechst33258染色證實了SK-N SH細胞神經(jīng)元分化特性。MAP-2免疫熒光和Hoechst33258染色顯示AD細胞模型組細胞突起減少、變短，失去正常的細胞極性，胞核變形。姜黃素和D22治療組SK-N SH細胞胞突起增多、變長，細胞極性恢復(fù)，核形態(tài)規(guī)則。 (5) Western blot檢測到SK-N SH細胞內(nèi)表達MAP-2a、MAP-2b兩種亞型，且MAP-2a亞型蛋白水平

13、高于MAP-2b亞型蛋白水平。MAP-2a亞型提示SK-N SH細胞已分化成熟。AD細胞模型組MAP-2蛋白表達水平明顯下降；姜黃素治療組和D22治療組SK-N SH細胞內(nèi)MAP-2蛋白的表達水平明顯增加。 結(jié)論： (1) Aβ42對SK-N SH細胞有毒性作用，且毒性作用與Aβ42的濃度呈正相關(guān)。 (2) Aβ42通過下調(diào)微管相關(guān)蛋白MAP-2的表達，降低細胞骨架的穩(wěn)定性，改變細胞骨架的生理功能，最終導(dǎo)致神經(jīng)細

14、胞死亡。 (3)姜黃素和D22(二去甲氧基姜黃素)能對抗Aβ42下調(diào)MAP-2蛋白表達的作用，通過提高微管的生長速率和修復(fù)頻率促進微管形成，發(fā)揮對神經(jīng)細胞形態(tài)和功能的保護作用。 (4)姜黃素及其衍生物D22的母體結(jié)構(gòu)二芳基庚酮和芳香環(huán)上的4位羥基是發(fā)揮神經(jīng)保護作用的關(guān)鍵化學(xué)結(jié)構(gòu)和活性基團，3位甲氧基對4位羥基有抑制作用。衍生物D22去掉了苯環(huán)上的3位甲氧基而保留了4位羥基，因而其對抗Aβ42的作用比母體姜黃素更強，但IZ