細(xì)胞色素C氧化酶Ⅱ亞基甲基化在慢性阻塞性肺疾病肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、第一章 COPD肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和COX表達(dá)與功能的改變及其發(fā)生機(jī)制初探 目的：觀察COPD患者肺組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、COX功能和COX II表達(dá)變化，探討COPD可能的發(fā)病機(jī)制。 方法：2007年9月至2008年5月在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院胸外科行肺切除術(shù)的周圍型肺癌患者病例20例，根據(jù)COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)和WHO吸煙調(diào)查方法標(biāo)準(zhǔn)將其分成3組：A組(非吸煙非COPD組)，7例；B組(吸煙非COPD組)，7例；C組(吸煙并

2、COPD組)，6例。TUNEL法檢測(cè)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)，分光光度法檢測(cè)COX活性，普通RT-PCR和熒光RT-PCR(RQ-PCR)檢測(cè)COX II mRNA表達(dá)，以及免疫組織化學(xué)和WB法檢測(cè)COX II蛋白的分布和表達(dá)。使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的各組計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，變量間采用單因素相關(guān)分析(Pearson)，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3、 結(jié)果：C組肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)[(13.8±1.9)％]較B組[(9.6±0.8)％]和A組[(5.9±1.0)％]均增高，任意兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。A組COX活性、COX II mRNA的△△Ct值和COX II蛋白OD值分別為(7.6±0.4)×10-1U/mg、(0.86±0.20)和(0.99±0.14)；B組分別為(6.0±0.6)×10-1U/mg、(0.81±0.15)和(0.81±0.09

4、)；而C組分別為(4.4±0.7)×10-1U/mg、(0.76±0.17)和(0.60±O.07)，各變量在A、B、C三組中依次下降，任意兩組間差異有顯著性(均P<0.05)。經(jīng)相關(guān)性分析，細(xì)胞凋亡指數(shù)與FEV1/Pre呈負(fù)相關(guān)(r=-0.846，P<0.01)，與吸煙指數(shù)正相關(guān)(r=0.794，P<0.01)。COX活性與FEV1/Pre呈正相關(guān)(r=0.842，P<0.01)，與吸煙指數(shù)負(fù)相關(guān)(r=-0.783，P<0.01)。

5、 結(jié)論：(1)COPD患者肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。(2)COPD患者肺組織COXII表達(dá)抑制并且COX活性下降。(3)吸煙可能與肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、COX II表達(dá)抑制及COX活性下降有關(guān)。(4)COX可能介導(dǎo)COPD肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。 第二章 COPD患者COX II的甲基化狀態(tài)及其與COPD的關(guān)系 目的：探討COPD患者COX II甲基化狀態(tài)及其與COPD的關(guān)系。 方法：2007年9月至2008年5月在中

6、南大學(xué)湘雅二醫(yī)院胸外科行肺切除術(shù)的周圍型肺癌患者病例20例，根據(jù)最新COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)和WHO吸煙調(diào)查方法標(biāo)準(zhǔn)將其分成3組：A組(非吸煙非COPD組)，7例；B組(吸煙非COPD組)，7例；C組(吸煙并COPD組)，6例，分別收集患者肺組織。同期在該院呼吸內(nèi)科住院的吸煙并COPD患者10例和健康體檢者20例，分為3組：D組(非吸煙非COPD組)，10例；E組(吸煙非COPD組)，10例(入選時(shí)均處于穩(wěn)定期)；F組(吸煙并COPD組)，10

7、例，分別收集其外周血5ml。提取肺組織和血標(biāo)本中基因組DNA，亞硫酸鹽修飾后MSP檢測(cè)COX II甲基化。使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以x±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間COX II甲基化陽性率差異用Fisher確切概率法進(jìn)行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：A、B、C三組肺組織標(biāo)本中COX II甲基化陽性率分別為71.4％(5/7

8、)、71.4％(5/7)和66.7％(4/6)，三組間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.50)。D、E、F三組血標(biāo)本中COXII甲基化陽性率分別為0％(0/10)、50％(5/10)和60％(6/10)。D組與E組或F組比較，COXII甲基化陽性率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.05)，而E組與F組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著(P>0.50)。 結(jié)論：COPD患者存在COX II甲基化，該異常甲基化可能與吸煙有關(guān)。 第三章 CSE誘導(dǎo)

9、HUVEC凋亡中COX II甲基化狀態(tài)改變及5-雜氮-2'-脫氧胞苷干預(yù)的影響 目的：研究CSE誘導(dǎo)HUVEC凋亡的機(jī)制，探討COX在其中的作用，并了解COX II甲基化是否參與其中機(jī)制。 方法：第一部分，體外培養(yǎng)HUVEC，給予不同濃度(0％-10％)和不同時(shí)間(0h-24h)的CSE處理，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，分光光度計(jì)檢測(cè)其COX和caspase-3的活性。第二部分，將HUVEC分為四個(gè)處理組：空白組，AZA組

10、，CSE(2.5％)組，AZA+CSE組，分別給予不同的干預(yù)，檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡指數(shù)和COX活性。熒光RQ-PCR和Western Blot分別檢測(cè)COX II mRNA和COX II蛋白表達(dá)。提取各組細(xì)胞DNA，MSP法檢測(cè)各組COX II甲基化狀態(tài)。用SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)。變量間采用單因素相關(guān)分析(Pearson)法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

11、義。 結(jié)果：第一部分：CSE誘導(dǎo)的HUVEC凋亡呈濃度-和時(shí)間-依賴。1％CSE組即出現(xiàn)HUVEC凋亡增加[(26.0±2.1)％]，2.5％CSE時(shí)凋亡指數(shù)達(dá)到(42.6±2.6)％。此后CSE濃度繼續(xù)增加，雖然凋亡仍在增加，但細(xì)胞壞死也逐漸明顯。10％CSE干預(yù)24h后HUVEC凋亡達(dá)到最高峰(49.5±0.7)％。2.5％CSE干預(yù)HUVEC，隨著干預(yù)時(shí)間的延長凋亡逐漸增多。與凋亡相反，隨著CSE干預(yù)濃度和時(shí)間的增加，CO

12、X活性下降愈明顯，同樣呈濃度-和時(shí)間-依賴。10％CSE干預(yù)24h后，COX活性下降約25.6％。在較低CSE干預(yù)濃度(0.5％-2.5％)時(shí)caspase-3活性隨著CSE濃度增加而增加，2.5％CSE組達(dá)到最大值(255.0±24.2％)。而在較高CSE濃度(5％-10％)干預(yù)時(shí)，caspase-3活性出現(xiàn)回降，10％CSE組降至(68.6±3.7)％，低于空白對(duì)照組。經(jīng)相關(guān)分析，HUVEC凋亡與COX活性呈負(fù)相關(guān)(r=-0.884

13、，P<0.01)，而與caspase-3活性無關(guān)(r=-0.236，P>0.05)。第二部分：與對(duì)照組相比，CSE組[(44.0±3.6)％]和AZA+CSE組[(21.7±2.3)％]HUVEC凋亡增加；而COX活性[分別為(5.94±0.36)×10-1U/mg和(6.83±0.26)×10-1U/mg]、COX II mRNA表達(dá)[分別為(0.82±0.06)和(1.18±0.08)]和COX II蛋白表達(dá)[分別為(0.73±0.

14、05)和(1.10±0.12)]均下降，三組間各指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。而AZA組與對(duì)照組比較無顯著差異。MSP檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CSE組和AZA+CSE組出現(xiàn)COXII甲基化陽性表達(dá)，而對(duì)照組和AZA組甲基化陰性。 結(jié)論：(1)CSE誘導(dǎo)HUVEC凋亡呈濃度-和時(shí)間-依賴性，該凋亡為非caspase-3-依賴，并由COX介導(dǎo)。(2)CSE可能通過誘導(dǎo)COX II發(fā)生甲基化而抑制COXII轉(zhuǎn)錄。(3)AZA能一定程度逆轉(zhuǎn)