靶向人Id3基因microRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及其對A549細(xì)胞增殖功能的影響.pdf

1、肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，已成為全世界惡性腫瘤致死的主要原因。目前，治療肺癌的主要方法包括手術(shù)、放療和化療，但5年存活率仍僅16％。對肺癌發(fā)病機(jī)制的深入研究并探尋新的分子靶標(biāo)，對防治肺癌和降低死亡率具有重要意義。
　　 分化抑制因子，又稱DNA結(jié)合抑制因子(inhibitors of DNA binding/ differentiation，Id)，屬于螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，Id蛋白與E蛋白結(jié)合形成

2、二聚體后，可抑制E蛋白與其他組織特異性堿性HLH(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，對bHLH轉(zhuǎn)錄因子活性起負(fù)調(diào)節(jié)作用。哺乳動物細(xì)胞含有四種Id分子，即Id1～I(xiàn)d4，編碼基因分別定位于不同的染色體上。Id3作為血清誘導(dǎo)的立即早期基因參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程，包括對細(xì)胞周期、分化及凋亡過程調(diào)控。
　　 Id3表達(dá)異常與腫瘤、自身免疫性疾病、動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。Id3在不同組織種類的腫瘤中有著截然不同的表達(dá)譜，在原發(fā)性結(jié)直腸癌

3、、星形細(xì)胞瘤和鱗狀細(xì)胞癌中呈高表達(dá)，而在甲狀腺癌、卵巢癌中表達(dá)呈下降趨勢。Id3在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其與腫瘤惡性程度的關(guān)系目前尚未得到一致性的結(jié)論。目前認(rèn)為，Id3基因表達(dá)調(diào)控途徑和機(jī)制的復(fù)雜性決定了其功能的多樣性，Id3蛋白對細(xì)胞周期的調(diào)控具有細(xì)胞種類和階段特異性。因此，探討作為細(xì)胞調(diào)控蛋白的Id3分子在某些病理生理狀態(tài)下的生理、生物學(xué)功能具有重要意義。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，Id3基因在人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞中呈低表達(dá)水平，將外源

4、性Id3基因?qū)階549細(xì)胞，可導(dǎo)致細(xì)胞生長抑制并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 本課題將采用微RNA(microRNA，miRNA)干擾技術(shù)，對人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞內(nèi)/外源性Id3的表達(dá)進(jìn)行抑制，研究miRNA介導(dǎo)的Id3基因沉默對A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響，進(jìn)一步探討Id3基因在A549細(xì)胞生長調(diào)控中的作用。
　　 本研究根據(jù)靶基因Id3的mRNA序列，設(shè)計(jì)并合成4對靶向人Id3 mRNA的miRNA編碼寡核苷酸(ol

5、igo)片段，構(gòu)建4組miRNA干擾載體(pcDNA/miRId3-1，-2，-3，-4)。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將pcDNA/miRId3導(dǎo)入A549細(xì)胞，RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，干擾載體pcDNA/miRId3能高效地抑制A549細(xì)胞中Id3 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。隨后，為進(jìn)一步確認(rèn)Id3轉(zhuǎn)基因表達(dá)導(dǎo)致A549細(xì)胞增殖抑制和凋亡的作用，我們將篩選出的干擾效果較好的miRNA干擾質(zhì)粒pcDNA/miRId3-1和

6、pEGFP/Id3共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。RT-PCR和Western blot結(jié)果表明，pcDNA/miRId3轉(zhuǎn)染或與pEGFP/Id3共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，分別可對A549細(xì)胞內(nèi)源性或外源性的Id3 mRNA和蛋白表達(dá)水平產(chǎn)生明顯下調(diào)作用。MTT和Annexin V/7-AAD雙染法結(jié)果表明，pcDNA/miRId3-1和pEGFP/Id3共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，可以逆轉(zhuǎn)外源性Id3基因表達(dá)致A549細(xì)胞增殖抑制和早期凋亡作用。