可溶性細(xì)胞因子在肌樣分化間充質(zhì)干細(xì)胞免疫特性中的作用.pdf

1、本研究擬通過(guò)建立體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肌樣細(xì)胞模型，然后鑒定分化前后MSCs分泌抗免疫蛋白分子的特性，并在體外同種異體混合白細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中探討分化前后干細(xì)胞對(duì)免疫細(xì)胞的耐受能力。課題分為三個(gè)部分:
　　第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為肌樣細(xì)胞的研究
　　目的：探討體外使用5-氮雜胞苷(5-Azacytidine，5-aza)誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肌樣細(xì)胞分化的方法，為研究和臨床使用干細(xì)胞治療心臟疾病奠定

2、基礎(chǔ)。方法：體外分離培養(yǎng)Wistar大鼠骨髓MSCs，傳代擴(kuò)增，使用含10μM5-azaIMDM培養(yǎng)液常規(guī)條件下孵育P4～P5MSCs24h，以后每3天換一次正常IMDM細(xì)胞液直到第14天。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，通過(guò)免疫組化鑒定肌樣細(xì)胞特有標(biāo)記物MHC，RT-PCR鑒定α-MHC和β-MHC基因表達(dá)，Westemblot鑒定MHC蛋白的表達(dá)。結(jié)果：誘導(dǎo)分化后的d-MSCs形態(tài)上發(fā)生改變，細(xì)胞體積大小不等，胞核較前增大，個(gè)別可見多核

3、，部分細(xì)胞聚集成團(tuán)簇樣，有管狀結(jié)構(gòu)形成;免疫組化結(jié)果顯示，MSCs不表達(dá)肌樣細(xì)胞特有標(biāo)記物MHC，d-MSCs開始表達(dá)MHC;RT-PCR顯示d-MSCs表達(dá)α-MHC和β-MHC基因的水平較MSCs明顯增加;通過(guò)Westemblot鑒定d-MSCs表達(dá)MHC蛋白的量也比MSCs明顯增加，與基因水平的結(jié)果一致。結(jié)論：使用5-氮胞苷可成功誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肌樣細(xì)胞。
　　第二部分探討MSCs肌樣細(xì)胞分化前后分泌抗免疫細(xì)胞

4、因子的特性
　　目的：探討大鼠骨髓MSCs向肌樣細(xì)胞分化后，其分泌抗免疫細(xì)胞因子特性是否有改變，進(jìn)一步闡明MSCs分化以后失去其免疫優(yōu)勢(shì)的具體機(jī)制。方法：體外建立5-aza誘導(dǎo)MSCs分化為肌樣細(xì)胞的模型，通過(guò)RT-PCR篩選基因水平TGF-β、IL10、IDO和影響PGE2分泌的5個(gè)基因COX1、COX2、Ptges1、Ptges2、cPtges在分化前后是否有改變;選擇有改變的靶基因，通過(guò)Westernblot進(jìn)一步檢測(cè)其蛋白

5、水平是否有改變;最后通過(guò)ELISA檢測(cè)分化前后干細(xì)胞分泌目標(biāo)細(xì)胞因子的能力是否有改變。結(jié)果：RT-PCR篩選結(jié)果顯示TGF-β、IL10、IDO基因在MSCs分化前后表達(dá)無(wú)明顯差異，影響PGE2表達(dá)的COX1、Ptges2、cPtges基因表達(dá)也無(wú)明顯改變，只有COX2、Ptges1基因在分化后表達(dá)水平明顯降低，有顯著性差異(P＜0.05);Westemblot檢測(cè)結(jié)果顯示分化后d-MSCs表達(dá)COX2、Ptges1蛋白的水平也明顯降低

6、(P＜0.05);ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中分泌的PGE2水平顯示，分化后d-MSCs分泌PGE2的能力明顯降低(P＜0.05)。結(jié)論：MSCs心肌細(xì)胞分化以后分泌抗免疫PGE2水平下降,這種分子機(jī)制改變可能參與了d-MSCs引起的同種異體免疫反應(yīng)。
　　第三部分PGE2在同種異體混合白細(xì)胞試驗(yàn)中對(duì)肌樣分化后MSCs的保護(hù)作用
　　目的：進(jìn)一步證實(shí)MSCs分化后誘導(dǎo)了同種異體白細(xì)胞的殺傷作用，探討PGE2能否起到保護(hù)干細(xì)胞不

7、受免疫細(xì)胞損傷的作用。方法：用不同濃度PGE2處理MSCs或d-MSCs72h后，通過(guò)LDH檢測(cè)試劑盒測(cè)定培養(yǎng)液中釋放的LDH量，鑒定單純PGE2對(duì)干細(xì)胞的毒性作用;分離Lewis大鼠外周血白細(xì)胞(peripheralbloodleukocytes，PBLs)，與分化前后Wistar大鼠干細(xì)胞進(jìn)行混合白細(xì)胞試驗(yàn)，常規(guī)孵育72h后檢測(cè)培養(yǎng)基中LDH釋放量;為了評(píng)價(jià)PGE2的作用，我們直接加10ng/ml或50ng/mlPGE2在d-MSC

8、s混合白細(xì)胞試驗(yàn)體系中，檢測(cè)培養(yǎng)基中LDH釋放量。同時(shí),我們也使用PGE2預(yù)處理d-MSCs4天，或預(yù)處理PBLs5h，然后再進(jìn)行混合白細(xì)胞試驗(yàn)，檢測(cè)培養(yǎng)基中LDH釋放量。結(jié)果：10ng/ml或50ng/mlPGE2處理干細(xì)胞后，與對(duì)照組相比LDH釋放量無(wú)明顯改變(P＞0.05)，說(shuō)明單純PGE2對(duì)MSCs或d-MSCs無(wú)明顯細(xì)胞毒性;分化前后干細(xì)胞與同種異體混合白細(xì)胞反應(yīng)，MSCs實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組LDH釋放量無(wú)明顯差別，d-MSCs實(shí)驗(yàn)

9、組較對(duì)照組釋放較多LDH(P＜0.05)，證實(shí)MSCs分化后誘導(dǎo)了同種異體白細(xì)胞的殺傷作用;直接PGE2處理組(10PGE2+PBLs或50PGE2+PBLs)與對(duì)照組相比，釋放LDH量增加，直接加入PGE2不能起到保護(hù)d-MSCs的作用;PGE2預(yù)處理d-MSCs組（10p-PGE2+PBLs或50p-PGE2+PBLs）與+PBLs實(shí)驗(yàn)組相比釋放LDH量明顯降低(P＜0.05)，兩個(gè)預(yù)處理組與對(duì)照組相比釋放LDH量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞

10、0.05)，PGE2預(yù)處理d-MSCs可起到保護(hù)細(xì)胞的作用;PGE2預(yù)處理PBLs組（10PGE2+p-PBLs或50PGE2+p-PBLs）與+PBLs實(shí)驗(yàn)組相比釋放LDH量明顯降低(P＜0.05)，兩個(gè)預(yù)處理組與對(duì)照組相比釋放LDH量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，PGE2預(yù)處理PBLs也可起到減少同種異體白細(xì)胞毒作用。結(jié)論：肌樣分化后干細(xì)胞分泌PGE2水平的降低參與了d-MSCs引起的同種異體免疫反應(yīng)，使用PGE2預(yù)處理d-MSC或