超聲造影劑攜基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1小干擾RNA阻逆大鼠肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)是降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的重要酶類，幾乎能降解ECM的所有成分，已發(fā)現(xiàn)26種，按作用底物不同分為膠原酶、明膠酶、基質(zhì)溶素、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶等。而基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子(Tissue inhibitor of Matrixmetalloproteinase ,TIMP)是近年發(fā)現(xiàn)的MMPs的天然抑制劑，迄今發(fā)現(xiàn)有4種

2、，TIMP-1、2、4為可溶性分泌蛋白，TIMP-3是一種結(jié)合ECM的非可溶性蛋白。TIMP主要功能是通過對MMPs的抑制作用，調(diào)節(jié)ECM代謝，抑制新生血管生成，阻礙MMPs介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞移動，抑制基質(zhì)中促血管生成因子的釋放，防止ECM降解，在ECM改建和肝纖維化的病理過程中發(fā)揮重要作用。 本課題利用RNAi技術(shù)設(shè)計(jì)TIMP-1的siRNA真核表達(dá)載體，以降解TIMP-1的mRNA，使TIMP-1在翻譯過程中斷，阻止其蛋白表達(dá)，

3、解除對MMPs抑制。 然而如何將所構(gòu)建的TIMP-1 siRNA表達(dá)載體高效、安全轉(zhuǎn)達(dá)肝組織并能在相應(yīng)細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)其抑制效果仍是所有基因治療得以實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵問題。 本課題應(yīng)用RNAi技術(shù)構(gòu)建抑制TIMP-1的真核表達(dá)載體TIMP-1 pRNAT-U6.2siRNA(TIMP-1 siRNA)，并應(yīng)用超聲造影劑微泡技術(shù)攜帶TIMP-1 siRNA轉(zhuǎn)染肝纖維化大鼠，觀察其對大鼠血清學(xué)、肝組織結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)的影響，為肝纖維化基因治

4、療提供高效、特異基因及安全、有效基因轉(zhuǎn)載途徑。 本實(shí)驗(yàn)分為以下四個(gè)部分。 第一部分基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1 siRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 方法 1.根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，在TIMP-1 mRNA序列中選擇2個(gè)特異性靶序列(447-465nt、552-540nt)及1條無關(guān)對照序列。 2.體外合成對應(yīng)發(fā)卡樣DNA片段，將其克隆入pGEM-T連接載體，BamH I和Xho I分別雙酶切pGE

5、M-T及表達(dá)載體pRNAT-U6.2，膠回收粘末端將特異序列定向亞克隆構(gòu)建TIMP-1 pRNAT-U6.2/si RNA真核表達(dá)質(zhì)粒并測序。 3.Lentivirus病毒包裝構(gòu)建TIMP-1 pRNAT-U6.2/Lenti siRNA慢病毒表達(dá)載體。 4.用脂質(zhì)體包裹TIMP-1 siRNA質(zhì)粒、單純慢病毒表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染T6細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察TIMP-1 pRNAT-U6.2 siRNA質(zhì)粒及病毒載體在T6中表達(dá)

6、，RT-PCR及FQ-PCR檢測T6細(xì)胞TIMP-1 mRNA在TIMP-1 siRNA干擾下的表達(dá)水平。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用采用X±S表示；兩組均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)(t-test)；兩組以上均數(shù)的比較用方差分析(ANVOA)。 第二部分建立肝纖維化大鼠模型 方法 1.SPF級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(150±10)g，1％二甲基亞硝胺(dimeth

7、ylnitrosamine，DMN)按10 mg/kg，腹腔內(nèi)注射，第1周連續(xù)3次，第2、3、4、5、6周各連續(xù)2次；對照組同時(shí)間、同劑量生理鹽水腹腔注射。 2.第1次注藥后第1、2、4、6、8各周隨機(jī)取5只大鼠，取血及肝組織，Elisa方法測血清TIMP-1、MMP-1、HA、LN、CP-Ⅰ、CP-Ⅲ含量；HE染色觀察肝組織結(jié)構(gòu)，按1995年肝纖維化分類標(biāo)準(zhǔn)鑒定；Masson染色觀察肝組織膠原纖維含量，免疫組化檢測肝組織內(nèi)TI

8、MP-1蛋白表達(dá)，原位雜交鑒定在肝組織內(nèi)TIMP-1 mRNA表達(dá). 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：圖像分析方法均采用病理分析儀高清晰圖像處理系統(tǒng)，每張切片取四周及中央5個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域均取陽性反應(yīng)最多的視野，測定陽性反應(yīng)面積百分比(陽性面積/肝組織面積x 100％)，取平均值。采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示，采用t檢驗(yàn)，方差分析比較不同組間數(shù)值差異顯著性，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 第三部分基質(zhì)金屬

9、蛋白酶抑制因子-1 siRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染肝纖維化大鼠對大鼠血清學(xué)、肝形態(tài)學(xué)的影響 方法 1.分組：造模成功大鼠分為TIMP-1 siRNA病毒載體組(T-si組：24只肝纖維化大鼠，20 μl病毒載體+200 μl生理鹽水)，模型對照組(對照組：24只肝纖維化大鼠，220μl生理鹽水)，正常組(24只未經(jīng)特殊處理Wister大鼠220 μ1生理鹽水，以上藥物均經(jīng)大鼠陰莖靜脈快速注射。注藥后分別在2d、1w及2w處死

10、，取血及肝組織(一部分4％多聚甲醛處理石蠟包埋，另部分-80 C°冷凍切片y熒光纖維鏡下觀察及免疫組化等)。 2.標(biāo)本處理：雙抗體夾心ABC-ELISA法測TIMP-1、MMP-1、HA、LN、CP-Ⅰ、CP-Ⅲ含量(濃度：ng/ml)；HE染色觀察肝組織結(jié)構(gòu)及損傷分級；Masson染色測定肝組織膠原纖維含量；原位雜交、免疫組化法觀察肝內(nèi)TIMP-1 mRNA及蛋白分布；熒光顯微鏡下觀察肝組織內(nèi)TIMP-1 siRNA慢病毒表達(dá)

11、載體肝組織內(nèi)轉(zhuǎn)染效率。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：圖像分析方法均采用病理分析儀高清晰圖像處理系統(tǒng)，每張切片取四周及中央5個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域均取陽性反應(yīng)最多的視野，測定陽性反應(yīng)面積百分比(陽性面積/肝組織面積×100％)，取平均值。采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示，采用t檢驗(yàn)，方差分析比較不同組間數(shù)值差異顯著性，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 第四部分基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1 siRNA在超聲造影劑及超聲

12、輻照干預(yù)下對纖維化大鼠的影響 方法 1.超聲造影劑及基因載體混合：SonoVue是單分子層磷脂外殼的六氟化硫粉末，額定生理鹽水注入后形成親水端朝外、疏水鏈在內(nèi)的六面體結(jié)構(gòu)微泡，平均直徑2.5μm，濃度(1～5)×10<'8>/ml。TIMP-1 siRNA及造影劑以1：10混勻，置4℃冰箱30 min，使2者混合充分。 2.分組：TIMP-1 siRNA病毒組(Ⅴ組)：TIMP-1 siRNA 20 μl+200

13、μl生理鹽水：TIMP-1 siRNA病毒混合超聲微泡組(V+B組)：TIMP-1 siRNA 20 μl+200μl造影劑；TIMP-1 siRNA病毒混合超聲微泡+肝區(qū)超聲輻照組(V+B+U組)：TIMP-1 siRNA 20 μl+200μl造影劑，同時(shí)機(jī)械指數(shù)(MI)1.0超聲輻照肝區(qū)5 min；造模對照組(C組)：220 μl生理鹽水，以上藥物均經(jīng)大鼠陰莖靜脈快速注射。分別于2 d、1 w及2w后各組隨機(jī)處理8只：取血、無菌取

14、肝腎及心肌組織，兩份保存，一份入4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，5μm切片，另一份迅速凍存。 3.標(biāo)本處理：ELISA方法測TIMP-1、MMP-1、HA、LN、CP-Ⅰ、CP-Ⅲ含量；各組織快冷凍切片，熒光顯微鏡觀察組織內(nèi)TIMP-1 siRNA的熒光表達(dá)；HE、Masson染色觀察肝組織結(jié)構(gòu)及膠原含量；提取肝組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄做熒光定量RT-PCR檢測肝組織內(nèi)TIMP-1 mRNA表達(dá)量。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：圖像分析方法

15、均采用病理分析儀高清晰圖像處理系統(tǒng)，每張切片取四周及中央5個(gè)區(qū)域-每個(gè)區(qū)域均取陽性反應(yīng)最多的視野，測定陽性反應(yīng)面積百分比(陽性面積/肝組織面積x 100％)，取平均值。采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示，采用t檢驗(yàn)，方差分析比較不同組間數(shù)值差異顯著性，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 1.成功篩選構(gòu)建了TIMP-1 pRNAT-U6.2 siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒及Lentivirus病毒包裝的

16、TIMP-1 pRNAT-U6.2/Lenti siRNA慢病毒表達(dá)載體。 2.首次將TIMe-1 pRNAT-U6.2 siRNA質(zhì)粒及TIMP-1 pRNAT-U6.2 siRNA/LentisiRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染肝星形細(xì)胞(T6)，鑒定其對TIMe-1表達(dá)的沉默效應(yīng)，TIMe-1基因447-470bp做為siRNA插入序列的表達(dá)載體沉默效應(yīng)最顯著。 3.應(yīng)用肝毒性藥物DMN成功建立大鼠肝纖維化模型，系統(tǒng)觀察造模各

17、時(shí)期肝組織結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)變化及血清學(xué)相關(guān)指標(biāo)的改變，為研究肝纖維化病理及治療肝纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 4.首次將TIMe-1 siRNA靜脈注射于活體肝纖維化大鼠體內(nèi)，在體抑制TIMP-1表達(dá)顯著，血清MMe-1含量增高，TIMe-1及HA、CP-1等相關(guān)肝纖維指標(biāo)降低，纖維化肝組織內(nèi)膠原纖維含量減少、肝組織結(jié)構(gòu)有一定改善。 5.首次應(yīng)用超聲造影劑混合TIMP-1 pRNAT-U6.2/Lenti siRNA共同輸注肝纖維化大