上游刺激因子2(USF2)對(duì)Smurf1和Smurf2的功能調(diào)控研究.pdf

1、研究目的:
　　 證明USF2是泛素連接酶Smurf1和Smurf2的負(fù)性轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)Smurf1/2在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平上有抑制作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，更進(jìn)一步研究USF2對(duì)Smurf1/2的發(fā)揮抑制作用的功能區(qū)域。
　　 研究方法:
　　 一.USF2與其截短體真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 1.Myc-USF2與其截短體Myc-USF2(1-235aa)、Myc-USF2(236-346aa)的

2、構(gòu)建根據(jù)USF2基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA文庫(kù)。再以cDNA為模板，分別取USF2、USF2(1-235aa)、USF2(236-346aa)上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的基因片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離、回收、酶切后，插入pCMV-Myc的多克隆位點(diǎn)Kpn(Ⅰ)和Sal(Ⅰ)之間。連接產(chǎn)物經(jīng)E.coliDH5α菌株轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆并提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性雙酶切鑒定后，陽(yáng)性克隆送測(cè)序測(cè)序，測(cè)序正確的即為

3、Myc-USF2、USF2(1-235aa)、USF2(236-346aa)。
　　 2.轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞驗(yàn)證重組質(zhì)粒的表達(dá)
　　 各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48小時(shí)后，收取細(xì)胞，制作蛋白樣品，后經(jīng)由Westernblot驗(yàn)證其在真核細(xì)胞中的正確表達(dá)。
　　 二.USF2對(duì)Smurf1、Smurt2的功能調(diào)控研究
　　 1.Smurf1/2對(duì)USF2的調(diào)控作用
　　 梯度轉(zhuǎn)染Flag-Smurf1或Flag-

4、Smurf2，48小時(shí)后，收取并裂解細(xì)胞，制作蛋白樣品，經(jīng)Westernblot驗(yàn)證其在細(xì)胞中對(duì)USF2的調(diào)控作用。內(nèi)源性免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Smurfs和USF2是否存在相互作用，實(shí)驗(yàn)組使用USF2抗體進(jìn)行IP，對(duì)照組使用小鼠NormalIgG抗體，Smurf1抗體和Smurf2抗體檢測(cè)IP樣品，以此判斷USF2與Smurf1或Smurf2之間有無相互作用。
　　 2.USF2抑制Smurf1/2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)

5、　　 梯度過表達(dá)Myc-USF2，Westernblot檢測(cè)Smurf1/2的蛋白水平的變化，再利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)Smurf1/2的mRNA水平，檢測(cè)USF2對(duì)Smurf1/2蛋白及轉(zhuǎn)錄水平的影響。為了進(jìn)一步驗(yàn)證USF2對(duì)Smurf1/2的調(diào)節(jié)作用，細(xì)胞中依次轉(zhuǎn)染USF2siRNA及ControlsiRNA，敲低細(xì)胞內(nèi)源USF2，再分別利用Westernblot和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)Smurf1/2蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平的變化。

6、利用生物信息學(xué)段分析Smurf1/2的啟動(dòng)子區(qū)是否含有E-box結(jié)構(gòu)域，之后構(gòu)建了含有Smurf1/2promoter區(qū)E-box結(jié)構(gòu)域的PGL3-enhance報(bào)告基因載體，通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來驗(yàn)證USF2對(duì)Smurf1/2啟動(dòng)子活性的抑制作用。
　　 3.USF2結(jié)合Smurf1/2啟動(dòng)子區(qū)
　　 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)，來確認(rèn)USF2可以結(jié)合Smurf1/2啟動(dòng)子區(qū)，進(jìn)一步證實(shí)USF2是Smurf1/2的

7、轉(zhuǎn)錄抑制因子。首先設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行體內(nèi)染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)，從而證實(shí)在體內(nèi)USF2可以結(jié)合Smurf1/2啟動(dòng)子區(qū)。為了確證USF2在體外可以直接結(jié)合Smurf1/2啟動(dòng)子區(qū)，我們首先純化GST-USF2蛋白，并驗(yàn)證其正確表達(dá)，然后制作包含Smurf1/2E-box結(jié)構(gòu)域的生物素標(biāo)記探針，進(jìn)行體外凝膠遷移(EMSA)實(shí)驗(yàn)。其中，為了進(jìn)一步確認(rèn)結(jié)果的可靠性和確認(rèn)USF2和Smurf1/2promoter區(qū)結(jié)合的特異性，我們?cè)O(shè)計(jì)了冷

8、探針競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，即使用不同高濃度的未標(biāo)記生物素的冷探針和突變冷探針，競(jìng)爭(zhēng)生物素探針與USF2蛋白的結(jié)合。另外我們使用USF2抗體，進(jìn)行超阻滯實(shí)驗(yàn)，以排除其他基因或非特異性蛋白帶來的影響。
　　 三.USF2對(duì)Smur1/2發(fā)揮抑制效應(yīng)功能區(qū)的研究
　　 將Myc-USF2、Myc-USF2(1-235aa)、Myc-USF2(236-346aa)轉(zhuǎn)染到MCF7細(xì)胞中，48h后收集并裂解細(xì)胞，通過Westernblot及實(shí)時(shí)

9、定量PCR確定USF2抑制Smurf1/2轉(zhuǎn)錄水平的具體功能區(qū)域。
　　 研究結(jié)果:
　　 一.USF2與其截短體真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 1.成功構(gòu)建重組質(zhì)粒Myc-USF2、USF2(1-235aa)、USF2(236-346aa)。
　　 挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定，將酶切陽(yáng)性結(jié)果送測(cè)序，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒說明Myc-USF2、USF2(1-235aa)、USF2(236-346aa)構(gòu)

10、建成功。
　　 2.轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞重組質(zhì)粒的正確表達(dá)
　　 將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，經(jīng)Westernblot驗(yàn)證其在真核細(xì)胞中能夠正確表達(dá)。
　　 二.USF2對(duì)Smurf1、Smurf2的功能調(diào)控研究
　　 1.Smurf1/2對(duì)USF2無調(diào)控作用
　　 梯度轉(zhuǎn)染Flag-Smurf1或Flag-Smurf2，由Westernblot驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)USF2蛋白水平不隨著Smurf1/2的變化而變

11、化，初步認(rèn)為USF2不是Smurf1/2的泛素化底物。而后進(jìn)行的內(nèi)源性Co-IP實(shí)驗(yàn)證明，和使用NormalIgG抗體的對(duì)照組一樣，使用USF2抗體進(jìn)行IP的實(shí)驗(yàn)組沒有檢測(cè)到Smurf1或Smurf2，說明USF2與Smurfs之間無相互作用。
　　 2.USF2對(duì)Smurf1/2轉(zhuǎn)錄有抑制作用
　　 梯度轉(zhuǎn)染Myc-USF2，Westernblot檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)Smurf1/2的蛋白水平呈現(xiàn)梯度下降，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)

12、Smurf1/2的mRNA水平也下降，說明USF2對(duì)Smurfs的蛋白水平和mRNA水平均有抑制作用。敲低細(xì)胞內(nèi)源USF2后則得到相反的效應(yīng)。為了確證USF2對(duì)Smurfs是在轉(zhuǎn)錄水平還是轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮抑制作用，我們構(gòu)建了含有Smurf1/2promoter區(qū)E-box結(jié)構(gòu)域的PGL3-enhance報(bào)告基因，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)USF2對(duì)Smurf1/2轉(zhuǎn)錄活性具有明顯的抑制作用，敲低反之。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)USF2對(duì)Smurf1/2是

13、在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮了抑制作用而最終導(dǎo)致其大蛋白水平的降低。
　　 3.USF2結(jié)合Smurf1/2啟動(dòng)子區(qū)
　　 ChIP實(shí)驗(yàn)明確USF2在體內(nèi)可以結(jié)合Smurf1/2的啟動(dòng)子，證實(shí)USF2是Smurf1/2的轉(zhuǎn)錄因子。純化GST-USF2蛋白，Westernblot并驗(yàn)證其正確表達(dá)。進(jìn)行體外EMSA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果得到USF2和Smurf1/2promoter區(qū)結(jié)合能夠產(chǎn)生DNA-蛋白復(fù)合體，即說明USF2在體外可以直接結(jié)合Sm

14、urf1/2的啟動(dòng)子。使用不同高濃度的冷探針，可以成功競(jìng)爭(zhēng)生物素探針與USF2蛋白的結(jié)合;而使用突變探針后，DNA-蛋白復(fù)合體結(jié)合條帶消失，從而進(jìn)一步確證USF2特異的結(jié)合Smurf1/2的啟動(dòng)子。另外，使用USF2抗體進(jìn)行EMSA超阻滯實(shí)，發(fā)現(xiàn)結(jié)合條帶遷移明顯滯后。以上說明USF2特異性結(jié)合Smurf1/2啟動(dòng)子區(qū)。
　　 三.USF2對(duì)Smur1/2發(fā)揮抑制效應(yīng)功能區(qū)的研究
　　 轉(zhuǎn)染Myc-USF2、Myc-USF

15、2(1-235aa)、Myc-USF2(236-346aa)48h后，Westernblot及實(shí)時(shí)定量PCR，發(fā)現(xiàn)Myc-USF2、Myc-USF2(236-346aa)對(duì)Smurf1/2的蛋白及轉(zhuǎn)錄水平有抑制作用，而Myc-USF2(1-235aa)不具備抑制效應(yīng)，說明對(duì)Smurf1/2發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制的功能區(qū)域主要是USF2的第236到第346氨基酸之間的區(qū)域。
　　 結(jié)論及意義:
　　 本研究首次發(fā)現(xiàn)了Smurf1和S