血管緊張素Ⅱ誘導腎小球系膜細胞增殖及炎癥介質表達的信號機制研究.pdf

1、隨著社會經濟發(fā)展和人們生活方式的改變，人類疾病譜正在發(fā)生變化，慢性腎臟病(CKD)已呈現流行特征，并成為21世紀全球性的公共衛(wèi)生問題。CKD一旦發(fā)展為終末期腎臟病(ESRD)，則必須依賴腎臟替代治療(RRT)，即血液透析、腹膜透析、或腎移植來維持生命，給患者家庭及社會帶來沉重的經濟負擔和社會壓力。因此，早期診斷及防治慢性腎臟病有著特殊重要的意義。研究表明，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)，尤其是血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)在CKD的

2、發(fā)生和進展中發(fā)揮重要作用。AngⅡ是RAAS系統(tǒng)最主要的效應分子，業(yè)已證實AngⅡ不僅通過改變腎小球血流動力學促進腎小球硬化，還可促進系膜細胞、內皮細胞和腎小管上皮細胞增生、生長因子表達及細胞外基質積聚。Ang Ⅱ的作用是通過與Gq蛋白偶聯(lián)的Ⅰ型血管緊張素受體(AT1受體)完成的，而AT1受體為跨膜糖蛋白，本身不具有酪氨酸激酶(此酶介導有絲分裂的細胞信號)活性，也不直接與酪氨酸激酶發(fā)生聯(lián)系。本研究將深入探討Ang Ⅱ介導腎小球系膜細胞增

3、殖及炎癥介質的表達的信號轉導機制，這不僅有助于加深人們對CKD發(fā)病機制的認識，同時也為未來CKD治療策略的制定提供理論依據。 本研究包括兩部分內容： 一、c-Jun氨基末端激酶介導血管緊張素Ⅱ誘導的人腎小球系膜細胞增殖及炎癥介質表達 目的：AngⅡ可誘導體外培養(yǎng)的系膜細胞c-Jun氨基末端激酶(JNK)活化，但其活化后的生物學意義仍不清楚。本研究選用新型的JNK特異性阻斷劑SP-600125，探討JNK-c-Ju

4、n/AP-1信號通路在Ang Ⅱ誘導的腎小球系膜細胞增殖及炎癥介質表達中的作用。 方法：體外分離培養(yǎng)人腎小球系膜細胞，應用SP-600125預處理后加入AngⅡ刺激，應用Western Blot檢測JNK、細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)和p38的活性以及c-Jun磷酸化；應用熒光素酶(Luciferase)活性檢測法檢測c-Jun轉錄活性及單核細胞趨化蛋白(MCP-1)啟動子活性；凝膠電泳遷移率(EMSA)檢測活化蛋白-1(

5、AP-1)DNA結合活性；核酸酶保護法檢測MCP-1 mRNA表達；ELISA檢測培養(yǎng)上清中MCP-1、轉化生長因子(TGF-β1)和纖維連接蛋白(FN)的分泌；3H-胸腺嘧啶(3H-TdR)摻入法和細胞計數法測定系膜細胞的增殖。 結果：1.AngⅡ可呈時間依賴性和劑量依賴性的方式誘導JNK活化及c-Jun磷酸化，100 nmol/L Ang Ⅱ刺激15 min后，c-Jun磷酸化顯著增加，JNK活性明顯上調，30分鐘達到高峰，

6、是對照組的6.2倍，1 h后幾乎恢復到正常水平。 2.JNK特異性抑制劑SP-600125呈劑量依賴性的方式抑制Ang Ⅱ誘導的JNK活化和c-Jun磷酸化，當濃度為10μmol/L和20μmol/L時其抑制作用分別達75％和90％，SP-600 125對ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平均無抑制作用。 3.AngⅡ刺激后c-Jun轉錄活性及AP-1 DNA結合活性顯著增加，SP-600 125可呈劑量依賴的抑制A

7、ng Ⅱ誘導的c-Jun轉錄活性及AP-1 DNA結合活性的增加，20μmol/L SP-600125預處理幾乎完全阻斷c-Jun的反式激活。4.AngⅡ顯著增加MCP-1啟動子活性及MCP-1 mRNA表達，SP-600125可呈劑量依賴性的抑制Ang Ⅱ誘導的MCP-1啟動子活化和MCP-1 mRNA表達以及系膜細胞MCP-1、TGF-β和FN的分泌。5.1～20 μmol/L SP-600125以劑量依賴的方式抑制Ang Ⅱ促進的

8、系膜細胞3H-TdR摻入量和細胞計數的增加，而MEK1/2特異性抑制劑PD-98059和p38 MAPK特異性抑制劑SB-203580對Ang Ⅱ誘導的系膜細胞數目的增加無抑制作用。 結論：Ang Ⅱ→JNK/SAPK→c-Jun/AP-1信號通路在系膜細胞增殖和炎癥介質分泌中發(fā)揮一定的作用。JNK特異性抑制劑SP-600125能部分抑制Ang Ⅱ誘導的系膜細胞增殖和炎癥介質分泌。 二、血管緊張素Ⅱ通過Ros/EGFR/

9、JNK/AP-1信號通路誘導腎小球系膜細胞增殖 目的：我們前期的研究發(fā)現Ang Ⅱ可通過JNK/AP-1信號通路誘導腎小球系膜細胞增殖，但JNK/AP-1活化的上游通路尚不清楚。本研究探討活性氧(ROS)和表皮生長因子受體(EGFR)在Ang Ⅱ誘導的JNK/AP-1活化及系膜細胞增殖中的作用并探討ROS釋放的來源。 方法：體外培養(yǎng)人腎小球系膜細胞，應用3H-TdR摻入法和細胞計數測定系膜細胞增殖；熒光探針2，7-二氯二

10、氫熒光素乙酰乙酸(DCFDA)檢測細胞內ROS產生；化學發(fā)光法檢測尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性；實時定量RT-PCR檢測NADPH亞基p47phox和p67phox mRNA表達；Western Blot檢測p47phox和p67phox膜轉位以及EGFR、JNK和c-Jun磷酸化。 結果：1、Ang Ⅱ呈時間依賴性和劑量依賴性促進腎小球系膜細胞ROS產生。Ang Ⅱ刺激3 min，系膜細胞內ROS產生明顯

11、增加，至60 min達到高峰，系膜細胞ROS產生是對照組2.26倍；1、10、100nmol/L Ang Ⅱ刺激60 min，ROS產生分別是對照組的1.82、2.92和4.08倍。AT1受體(AT1R)拮抗劑losartan完全阻斷了Ang Ⅱ誘導的ROS產生，而AT2受體(AT2R)拮抗劑PD123319無抑制作用。2、NADPH氧化酶抑制劑apocynin和DPI幾乎完全阻斷Ang Ⅱ誘導的ROS產生，而線粒體complex Ⅰ抑

12、制劑魚藤酮(rotenone，ROT)、黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇(allopurinol，ALLO)、環(huán)氧化酶抑制劑吲哚美辛(indomethacin，INDO)、脂氧化酶抑制劑(nordmydroguiaretic acid，NDGA)、細胞色素P450氧化酶抑制劑酮康唑(ketoconazole，KETO)以及一氧化氮合成酶抑制劑N-硝基-L-甲酯精氨酸(NG-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAM

13、E)對Ang Ⅱ誘導的ROS產生均無明顯影響。Ang Ⅱ顯著刺激NADPH氧化酶活化及p47phox和p67phox膜轉位。3、Ang Ⅱ可呈時間依賴性和劑量依賴性誘導系膜細胞EGFR磷酸化，100 nmol/L Ang Ⅱ刺激30 min，EGFR磷酸化達到高峰，是對照組的3.96倍；AT1受體阻斷劑losartan、抗氧化劑乙酰半胱氨酸(NAC)以及NADPH氧化酶抑制劑apocynin和DPI著抑制Ang Ⅱ誘導的EGFR磷酸化，

14、同時EGFR拮抗劑AG-1478幾乎完全阻斷Ang Ⅱ誘導的系膜細胞增殖。4、Losartan、NAC、apocynin、DPI和AG-1478阻斷Ang Ⅱ誘導的JNK/AP-1活化和系膜細胞增殖。 結論：ROS/EGFR/JNKYAP-1信號通路參與Ang Ⅱ誘導的。腎小球系膜細胞增殖。NADPH氧化酶抑制劑和EGFR受體拮抗劑能顯著抑制Ang Ⅱ誘導的系膜細胞增殖，可能具有一定的治療作用。 本研究創(chuàng)新之處在於：

15、 1.首次發(fā)現：Ang Ⅱ可通過JNK-c-Jun/AP-1信號通路誘導腎小球系膜細胞增殖和MCP-1、TGF-β以及FN表達(參見：ZhangA，Ding G,Huang S，Wu Y,Pan X，Guan X，Chen R,Yang T.c-Jun NH2-temainal kinase medimionof angiotensin Ⅱ-induced proliferation of human mesangial cells

16、 Am J PhysiolRenal Physi01.2005；288：F111 8-1124)。 2.首次發(fā)現：活性氧依賴的表皮細胞生長因子受體磷酸化介導Ang Ⅱ誘導JNK-c-Jun/AP-1信號通路活化及腎小球系膜細胞增殖(參見：Ding G,Zhang A，Huang S，Pan X，Zhen G ,Chen R，Yang T.ANG Ⅱ induces c-JunNH2-terminal kinase activat