TP53、KRAS和EGFR基因在非小細(xì)胞肺癌順鉑輔助化療中腫瘤標(biāo)記物的研究.pdf

1、目的： 肺癌是一種常見(jiàn)的肺部惡性腫瘤，其死亡率已占癌癥死亡率之首。其中非小細(xì)胞肺癌（Non—small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌85％。早期NSCLC患者一般手術(shù)切除，但30％—60％的患者仍會(huì)復(fù)發(fā)并可能死亡。臨床研究已驗(yàn)證，順鉑（cisplatin）輔助化療可以提高術(shù)后NSCLC的生存期。對(duì)NSCLC患者術(shù)后行輔助化療目前已為標(biāo)準(zhǔn)，但總生存率僅能提高4.1％左右，可見(jiàn)多數(shù)患者并未得益于術(shù)后化療。篩選

2、出可能從中獲益者以使多數(shù)未獲益者免受化療帶來(lái)的副作用，這將是當(dāng)今肺癌研究的熱點(diǎn)。 隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，腫瘤研究已進(jìn)入分子水平時(shí)代?，F(xiàn)階段對(duì)于腫瘤的基礎(chǔ)及臨床研究分為分子機(jī)制、分子診斷、分子預(yù)后等幾個(gè)方面。沿用至今的惡性腫瘤TNM分期在預(yù)后的估計(jì)上已證明有巨大的價(jià)值，同時(shí)也深刻地影響著癌癥治療決策，但TNM分期本身并不能從分子層次預(yù)測(cè)和揭示抗癌治療的效果。因此迫切需要應(yīng)用分子診斷技術(shù)，對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理學(xué)機(jī)制及生物學(xué)行為從分

3、子水平上加以認(rèn)識(shí)，在解決腫瘤異質(zhì)性、分期的合理性、治療方案的設(shè)計(jì)和預(yù)后估計(jì)的準(zhǔn)確性上能提供更好的幫助。當(dāng)前，由于一系列新技術(shù)的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用（如基因芯片、組織芯片及蛋白芯片等），發(fā)現(xiàn)了許多肺癌新的分子標(biāo)記或分子標(biāo)記組合方式，可在TNM分期基礎(chǔ)上，把分子生物學(xué)的最新研究成果結(jié)合到TNM分期中，為NSCLC的預(yù)后和治療決策提供更有利的證據(jù)。因此，腫瘤的分子預(yù)后研究愈加受到臨床的重視。 一般認(rèn)為，順鉑藥物的毒性來(lái)自于cisplatin與D

4、NA的結(jié)合。Cisplatin—DNA共價(jià)復(fù)合物影響細(xì)胞的基本過(guò)程，包括DNA修復(fù)、細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡。參與這些過(guò)程的基因突變是腫瘤發(fā)生關(guān)鍵因素，其中，TP53、KRAS和EGFR基因突變是肺癌中最常見(jiàn)的突變。TP53突變至少在50％的Ⅰ—Ⅲ期肺癌患者中發(fā)生，多數(shù)突變?yōu)殄e(cuò)義突變；KRAS密碼子12和13的突變?cè)诜蜗侔┲械耐蛔兟蕿?0％—25％，在其它NSCLC中突變率較低；EGFR在40％—80％的NSCLC中過(guò)表達(dá)，尤其在非吸煙女

5、性肺腺癌中高發(fā)。本文，我們系統(tǒng)探討了國(guó)際肺癌研究組（IALT）體系中，TP53、KRAS和EGFR基因突變是否可以做為NSCLC順鉑輔助化療的分子標(biāo)記物，以篩選受益于順鉑輔助化療的NSCLC患者。 方法： 樣本783例樣本為國(guó)際輔助肺癌研究組（International Adjuvant Lung CancerTrial，IALT）的石蠟包埋組織，來(lái)自于14國(guó)家的28個(gè)中心。所設(shè)計(jì)標(biāo)本已獲倫理委員會(huì)使用許可，并按WHO2

6、004年分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類。 TP53基因突變檢測(cè)及分析QIAgen DNA提取試劑盒提取783例石蠟包埋切片的基因組DNA。TP53外顯子5至8經(jīng)PCR擴(kuò)增后，變性高壓液相質(zhì)譜儀（DHPLC）和測(cè)序法檢測(cè)TP53外顯子5至8的突變。初篩結(jié)果為陽(yáng)性的標(biāo)本，二次PCR擴(kuò)增及測(cè)序以確定TP53突變結(jié)果。TP53突變密碼子的分布及堿基變化特點(diǎn)與IARC TP53數(shù)據(jù)庫(kù)已知數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。 KRAS基因突變檢測(cè)及分析PCR擴(kuò)

7、增KRAS外顯子1（含密碼子12和13），產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序篩查KRAS突變。初篩結(jié)果為陽(yáng)性的標(biāo)本，二次PCR擴(kuò)增及測(cè)序以確定KRAS的突變。KRAS的突變特點(diǎn)與COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)資料進(jìn)行對(duì)比分析。 EGFR基因突變檢測(cè)及分析直接測(cè)序法篩查EGFR基因外顯子18至21存在的突變。初篩結(jié)果為陽(yáng)性的標(biāo)本，二次PCR擴(kuò)增及測(cè)序以確定EGFR的突變。EGFR的突變特點(diǎn)與COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)資料進(jìn)行對(duì)比。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Kaplan—

8、—Meier法計(jì)算生存率，Log—Rank檢驗(yàn)比較生存差別，利用多因素Cox回歸模型分析分析TP53，KRAS和EGFR基因突變與其它因素的相關(guān)性，以確定TP53，KRAS和EGFR基因突變的預(yù)后和預(yù)測(cè)價(jià)值。運(yùn)用SAS軟件，版本8.2。 結(jié)果： 1.TP53突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果 TP53突變率為46％（240/524），其密碼子突變熱點(diǎn)分布與IARC TPa3數(shù)據(jù)報(bào)道的基本一致。IALT數(shù)據(jù)中，堿基變化和功能變化分布特

9、點(diǎn)與以往報(bào)道中NSCLC的突變特點(diǎn)相一致。其中，G>T堿基變換（29.97％）為典型的吸煙患者的印跡突變。TP53基因突變與NSCLC臨床病理特征相關(guān)性分析表明，TP53突變與年齡、性別、TNM分期和切片的質(zhì)量具有相關(guān)性。 五年生存期的分析資料顯示，TP53突變對(duì)NSCLC整體無(wú)預(yù)后和預(yù)測(cè)意義。但是，存在一種趨勢(shì)：順鉑輔助化療有利于TP53野生型患者的生存，而有害于TP53突變型患者的生存（P=0.18總生存期和P=0.13無(wú)病

10、生存期）。在5年生存期分析中，非腺癌非小細(xì)胞肺癌中TP53突變狀態(tài)和順鉑治療有臨界值顯著相關(guān)性（P=0.05，無(wú)病生存期和P=0.25，總生存期）。 8年生存期分析結(jié)果與5年生存期的分析結(jié)果基本一致，并且TP53突變對(duì)非小細(xì)胞肺癌整體無(wú)病生存期組有預(yù)測(cè)意義（P=0.04），非腺癌非小細(xì)胞肺癌中TP53突變狀態(tài)和順鉑治療有顯著相關(guān)性（P=0.02，無(wú)病生存期和P=0.09，總生存期）。 2.KRAS突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果

11、KRAS的突變率為14％（98/718），其中90例突變發(fā)生在密碼子12，8例突變發(fā)生在密碼子13。KRAS在IALT肺癌中的突變模式與Cosmic數(shù)據(jù)庫(kù)所報(bào)道的相一致，突變主要為G>T轉(zhuǎn)換。KRAS基因突變與NSCLC臨床病理特征相關(guān)因素相關(guān)性分析表明，KRAS突變與TNM分期、病理組織分型和切片的質(zhì)量具相關(guān)性。 五年生存期的分析資料顯示，KRAS突變?cè)贜SCLC整體患者中有臨界值預(yù)后意義（P=0.08總生存期和P=0.02無(wú)

12、病生存期）；在NSCLC整體中，KRAS突變無(wú)預(yù)測(cè)意義。腺癌中KRAS基因突變率明顯高于非腺癌非小細(xì)胞肺癌（P<0.0001），KRAS基因突變狀態(tài)與非腺癌患者患者預(yù)后明顯相關(guān)（P=0.006，5年總生存期；P=0.0009，5年無(wú)疾病生存期）。 3.EGFR突變實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果 在208例肺腺癌標(biāo)本中，共檢測(cè)到EGFR基因突變?yōu)?2例（11％，22/208）。主要分布于外顯子19和外顯子21。EGFR基因突變特點(diǎn)，與COS

13、MIC數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道一致。EGFR基因突變與NSCLC臨床病理特征相關(guān)性分析表明，EGFR突變與臨床病理隔膜浸入有相關(guān)性（P=0.01）。 五年總生存期和無(wú)病生存期的分析資料顯示，在肺腺癌整體中，EGFR突變無(wú)預(yù)后和預(yù)測(cè)意義（P>0.05）。IALT中腺癌樣本量少（200例），突變率低（11％），因此需要進(jìn)一步擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行研究。 結(jié)論： 1.5年生存期和8年生存期分析結(jié)果表明，TP53基因突變對(duì)NSCLC無(wú)預(yù)后意

14、義。 2.8年無(wú)病生存期分析結(jié)果表明，TP53突變對(duì)NSCLC整體組有預(yù)測(cè)意義（P=0.04），順鉑輔助化療有利于TP53野生型患者的生存，而有害于TP53突變型患者的生存。 3.5年生存期和8年生存期分析結(jié)果一致表明，非腺癌非小細(xì)胞肺癌中TP53突變狀態(tài)和順鉑輔助化療有顯著相關(guān)性。 4.KRAS突變對(duì)順鉑化療NSCLC無(wú)預(yù)測(cè)意義，但在無(wú)病生存期分析中具有預(yù)后意義。 5.KRAS在不同組織分型中具有預(yù)后意