不同填充材料及脂肪源干細(xì)胞移植對骨質(zhì)疏松大鼠的影響.pdf

1、背景：
　　 骨質(zhì)疏松主要的特征是骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加同時(shí)易于骨折的代謝性疾病。隨著老齡化社會的發(fā)展，骨質(zhì)疏松患者不斷增多，如何有效預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為國內(nèi)外的熱門話題。根據(jù)原林教授提出的“筋膜學(xué)說”:人體可以看做是由尚未分化的非特異性結(jié)締組織（筋膜）支架構(gòu)成的支持與儲備系統(tǒng)與被該支架支持與包繞的已分化為各種功能細(xì)胞構(gòu)成的功能系統(tǒng)共同組成。建立在各種功能細(xì)胞的專能特化的基礎(chǔ)上的功能系統(tǒng)是被以筋膜支架中未分

2、化的干細(xì)胞為核心的支持與儲備系統(tǒng)支持和包繞的。支持與儲備系統(tǒng)內(nèi)未分化干細(xì)胞在微環(huán)境下通過分化為各種定向干細(xì)胞，源源不斷的為功能系統(tǒng)中各種功能細(xì)胞的更新提供細(xì)胞源泉，同時(shí)為功能系統(tǒng)中的各種功能細(xì)胞的代謝提供營養(yǎng)，維持其內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。因此，在支持與儲備系統(tǒng)的支持下功能系統(tǒng)才可能維持結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定，當(dāng)某種功能細(xì)胞在代謝過程中不能及時(shí)得到新細(xì)胞的補(bǔ)充，出現(xiàn)代謝障礙，機(jī)體就可能會出現(xiàn)相應(yīng)的病變。骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制正是在骨組織吸收后，筋膜結(jié)締組織

3、支架中未分化的干細(xì)胞未能充分向成骨細(xì)胞分化，造成骨形成不足而出現(xiàn)的一種疾病。因此，如何干預(yù)骨代謝過程中出現(xiàn)的負(fù)平衡，如何有效保證并增加筋膜結(jié)締組織支架中未分化的干細(xì)胞，使成骨細(xì)胞得到有效的補(bǔ)充，促進(jìn)骨的形成，重建骨的正平衡是治療骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵。
　　 目前，骨缺損的修復(fù)仍是骨科臨床中的棘手難題之一，以往研究顯示采用骨移植治療骨缺損的方法取得了一定的效果，但此方法存在較大的局限性。自體骨移植一直以來都被認(rèn)為是骨缺損修復(fù)的一個金標(biāo)準(zhǔn)

4、，由于植取骨量有限，已形成供區(qū)畸形，取骨手術(shù)也同樣增加了患者的創(chuàng)傷痛苦;異體骨移植雖然取材方便，易獲取，可減少手術(shù)次數(shù)，但是由于其具有抗原性，可引起機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)，同時(shí)存在著潛在傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)，故異體骨移植的并發(fā)癥也較多，如感染、骨折、骨不愈合等等。因此，人們對新型移植替代物的需求也不斷增加。目前各種骨水泥已經(jīng)備受青睞。伴隨人口老齡化的發(fā)展，骨質(zhì)疏松癥已成為威脅著中老年人健康的主要疾病。骨質(zhì)疏松極易并發(fā)骨折，同時(shí)這骨折也常伴有松質(zhì)骨

5、壓縮及骨缺損。伴隨著骨質(zhì)疏松絕對人口的增加，因各種原因引起的骨缺損合并骨質(zhì)疏松的患者也逐年增加。當(dāng)機(jī)體骨質(zhì)疏松時(shí)，由于破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，骨的吸收大于骨的形成，故新骨生成能力下降，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松骨缺損的愈合時(shí)間明顯延遲，而新生骨痂減少，愈合后的骨生物力學(xué)強(qiáng)度差，容易骨折。與常規(guī)骨缺損的治療相比，治療骨質(zhì)疏松骨缺損的花費(fèi)要更大且傳統(tǒng)方法療效欠佳。骨水泥已逐漸被應(yīng)用到骨質(zhì)疏松骨折骨缺損的輔助治療中，它一方面可增強(qiáng)固定螺釘，防止骨質(zhì)疏松骨折內(nèi)固定

6、的松動，另一方面填充骨折的缺損，使其復(fù)位及愈合更好，減少發(fā)生骨折后遺癥。磷酸鈣骨水泥近幾年也被應(yīng)用于椎體成形術(shù)來治療骨質(zhì)疏松椎體壓縮骨折，且療效良好。緩釋性骨長因子也漸漸被應(yīng)用于骨質(zhì)疏松骨缺損的治療中，這顯著加速了骨缺損的愈合，還在一定程度上改善局部的骨質(zhì)疏松，增強(qiáng)局部骨生物力學(xué)，降低骨折的發(fā)生幾率。
　　 脂肪組織同樣也是兩系統(tǒng)理論中的支持與儲備系統(tǒng)中重要組成部分，其分離出的脂肪源干細(xì)胞(adipose-derived ste

7、m cells，ADSCs)是筋膜結(jié)締組織支架中未分化干細(xì)胞的一種重要儲備形式。脂肪源干細(xì)胞的研究逐漸成為干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。脂肪源干細(xì)胞易于獲取，便于分離培養(yǎng);具有多向分化潛能，能跨胚層分化為三胚層內(nèi)的組織細(xì)胞，在特定的環(huán)境中可以向成骨、成軟骨、成脂、成肌和成神經(jīng)等誘導(dǎo)分化;具有免疫原性低和調(diào)節(jié)免疫功能。此外，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，脂肪源干細(xì)胞來源更廣泛，獲取更容易，對于病人而言，帶來的創(chuàng)傷和痛苦更小。這些特征為脂肪源干細(xì)胞的同體及異體

8、移植提供了更有利條件。因此，通過增加機(jī)體筋膜結(jié)締組織內(nèi)的未分化的脂肪源干細(xì)胞，促進(jìn)其成骨分化，增加骨形成，可能會對骨質(zhì)疏松起到預(yù)防和治療作用。
　　 利用糖皮質(zhì)激素建立骨質(zhì)疏松模型是目前國際上比較公認(rèn)的骨質(zhì)疏松癥藥物模型。長期注射大劑量的糖皮質(zhì)激素可引起體內(nèi)鈣磷代謝的紊亂，促進(jìn)甲狀旁腺素的分泌，抑制骨保護(hù)素的分泌，抑制成骨細(xì)胞增殖和活性，增加破骨細(xì)胞數(shù)量和活性等多種途徑促使骨形成減少，骨吸收增加，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

9、　　 為了探討異體脂肪源干細(xì)胞移植及不同骨填充材料對骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療作用，本實(shí)驗(yàn)通過觀察異體脂肪源干細(xì)胞移植對糖皮質(zhì)激素致骨質(zhì)疏松大鼠體內(nèi)血清鈣及磷代謝、骨密度、骨生物力學(xué)及骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)等方面的影響進(jìn)行綜合評價(jià)，同時(shí)通過觀察不同填充材料對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨切片的影響，探索一種新的骨質(zhì)疏松治療方法，為臨床骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療提供新的研究思路。
　　 目的：
　　 1、體外分離培養(yǎng)腹股溝皮下脂肪源干細(xì)胞，并對其

10、進(jìn)行多向分化能力和表面標(biāo)志的鑒定，以判斷在支持與儲備系統(tǒng)中是否存在未分化的脂肪源干細(xì)胞;
　　 2、通過對骨密度檢測，判斷長期給予糖皮質(zhì)激素是否成功模擬建立骨質(zhì)疏松模型？
　　 3、通過檢測大鼠鈣、磷、堿性磷酸酶，觀察異體脂肪源干細(xì)胞移植對糖皮質(zhì)激素致骨質(zhì)疏松大鼠的骨體內(nèi)鈣、磷代謝和骨形成的影響;
　　 4、通過檢測實(shí)驗(yàn)大鼠的骨密度，觀察異體脂肪源干細(xì)胞對糖皮質(zhì)激素致骨質(zhì)疏松大鼠骨質(zhì)量的影響;
　　 5、

11、通過檢測三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，觀察移植異體脂肪源干細(xì)胞對糖皮質(zhì)激素致骨質(zhì)疏松大鼠的骨強(qiáng)度和骨剛度的影響;
　　 6、通過對骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)觀察，探索異體脂肪源干細(xì)胞移植對糖皮質(zhì)激素致骨質(zhì)疏松大鼠骨組織微環(huán)境的影響;
　　 7、為進(jìn)一步證實(shí)“筋膜學(xué)說”中“通過動員支持與儲備系統(tǒng)中未分化干細(xì)胞可以治療退行性和衰老性疾病”提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 8、通過不同骨填充材料對去卵巢大鼠進(jìn)行填充后進(jìn)行相應(yīng)骨形態(tài)學(xué)觀察，篩選最佳骨材料

12、，為臨床新材料的應(yīng)用提供部分依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、取成年SD大鼠腹股溝皮下脂肪墊，Ⅰ型膠原酶消化，體外分離培養(yǎng)筋膜結(jié)締組織中脂肪源干細(xì)胞。分別通過形態(tài)學(xué)、成脂成骨誘導(dǎo)分化及利用流式細(xì)胞術(shù)對表面抗原CD11b、CD29、CD45、CD49d、CD90和CD106進(jìn)行鑒定4代脂肪源干細(xì)胞，判斷所培養(yǎng)的細(xì)胞是否為具有多向分化潛能的脂肪源干細(xì)胞。
　　 2、40只SD雌性大鼠隨機(jī)分成空白對照組（A組）、模型組（

13、B組）、治療組(C)和治療對照組（D組）。B、C和D組分別給予頸背部皮下注射醋酸潑尼松龍注射液8mg/kg，3次/周;A組給予頸背部皮下注射生理鹽水0.8mL，3次/周。12周后，將A組和B組處死取材，判斷造模是否成功。
　　 3、模擬骨質(zhì)疏松模型成功后，收集傳至第4代的脂肪源干細(xì)胞，經(jīng)尾靜脈向C組大鼠每只注射脂肪源干細(xì)胞3×106個，D組大鼠每只注射1mL生理鹽水，4周后處死取材。
　　 4、應(yīng)用水合氯醛麻醉大鼠后，用

14、促凝管接取心臟血液，室溫下放置8h后3000r/min，離心15min后制備血清，分裝后-70℃保存。全自動生化分析儀分別利用偶氮砷Ⅲ法、磷鉬酸比色法及速率法測定血清中鈣、磷和堿性磷酸酶的含量。取血完畢后，采用心臟放血處死，分別取出大鼠雙側(cè)股骨和第三至第五腰椎，去除周圍肌肉組織。利用雙能X線骨密度儀小動物測量軟件測定腰椎和右側(cè)股骨的骨密度值。利用BOSE生物材料動態(tài)力學(xué)試驗(yàn)機(jī)對左側(cè)股骨進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)，股骨背側(cè)向上，腹側(cè)向下，跨距為18

15、mm，速率為0.05mm/s，股骨壓斷時(shí)記錄最大載荷和剛度值。
　　 5、處死大鼠后取出右側(cè)脛骨上1/3部分，手術(shù)刀片矢狀面剖開，固定后酒精逐級脫水，分別浸入浸液Ⅰ（甲基丙烯酸甲酯70mL+鄰苯二甲酸二丁酯30mL）、浸液Ⅱ（浸液Ⅰ+過氧化苯甲酰1g）和浸液Ⅲ（浸液Ⅰ+過氧化苯甲酰2.5g）各2d，再用新鮮配制的浸液Ⅲ進(jìn)行包埋。Jung K重型切骨機(jī)連續(xù)切取6μm厚度切片，分別進(jìn)行組織學(xué)觀察（Gemisa染色）和類骨質(zhì)觀察（vo

16、n Kossa染色）。測量區(qū)域?yàn)樯L板下1mm至4mm范圍內(nèi)，采用Lecia QWin多功能彩色病理圖像分析軟件進(jìn)行骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析。具體參數(shù)包括骨小梁相對體積(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)和骨小梁分離度(Tb.Sp)和單位骨小梁破骨細(xì)胞數(shù)(OC.N)，均采用國際通用的公式進(jìn)行計(jì)算。
　　 6、骨質(zhì)疏松模型手術(shù):正常雌性大鼠全麻成功后，腹部剃毛，碘伏消毒。下腹正中切口，逐層進(jìn)入腹腔。找出一側(cè)

17、卵巢結(jié)扎切除。同法切除另一側(cè)?？p合腹膜及腹肌，最后縫合皮膚。一周拆線。3個月后即為骨質(zhì)疏松模型。
　　 7、待模型建立成功后，做材垂直骨面鉆孔深5毫米建立骨隧道。于隧道內(nèi)植入材料并輕輕壓實(shí)至骨面，然后用骨蠟封堵料植入手術(shù):全麻成功后雙下肢膝周前內(nèi)側(cè)剃毛。碘伏消毒。從膝部沿脛骨前棘切口長約2cm。逐層進(jìn)達(dá)骨膜下，骨膜下剝離顯露脛骨近端前內(nèi)側(cè)面，用直徑3毫米鉆頭。止血，沖洗，選取四種生物材料:β-磷酸三鈣(β-TCP);硅酸鈣(CS

18、)，降解后，釋放有益元素硅;摻鍶硅酸鈣(Sr-CS)，降解后，釋放有益元素硅、鍶;45s5生化陶瓷玻璃進(jìn)行填充骨缺損。縫合傷口。9周后處死取材。
　　 8、應(yīng)用HE染色、Giemsa、T-blue、Van gieson、番紅O&固綠進(jìn)行染色。觀察不同填充材料骨切片形態(tài)學(xué)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察，原代培養(yǎng)的ADSCs在24h后大部分可貼壁，細(xì)胞呈梭形、圓形、多邊形等。細(xì)胞長勢良好，7d后可以

19、1∶3比例傳代，之后每3d傳一次代。經(jīng)換液傳代至第4代，可見細(xì)胞形態(tài)均一，呈紡錘形或者多角形。體外可以向成脂、成骨誘導(dǎo)分化。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)CD29和CD90呈強(qiáng)陽性，CD106呈弱陽性，CD11b、CD45和CD49d呈陰性。
　　 2、長期大劑量給予糖皮質(zhì)激素后，與空白對照組大鼠血清鈣（3.63±0.20）、血清磷水平（3.12±0.83）和堿性磷酸酶水平（203.8±40.36）、腰椎骨密度（162.70±14.77）、

20、股骨骨密度（254.40±28.95）、骨強(qiáng)度(98.22±10.72)和骨剛度（192.66±42.28）比較，模型組大鼠血清鈣（2.60±0.18）和堿性磷酸酶水平（149.50±22.21）、腰椎骨密度（115.70±16.87）、股骨骨密度（183.40±12.28）、骨強(qiáng)度（58.88±12.53）和骨剛度（127.53±19.13）均顯著降低，而血清磷水平(5.25±1.11)顯著上升（P＜0.05）;骨小梁變細(xì)、變薄，骨小

21、梁排列紊亂，骨小梁間出現(xiàn)斷裂，間距增大，出現(xiàn)陷窩;骨小梁的數(shù)量（4.95±0.75）、相對體積(17.31±3.66)和厚度（35.82±3.88）均顯著降低(P＜0.05)，而骨小梁的分離度(171.30±29.72)增高，單位骨小梁破骨細(xì)胞數(shù)（52.70±10.34）增多（P＜0.05）。
　　 3、異體移植脂肪源干細(xì)胞后，與模型組比較，治療組大鼠血清鈣（3.01±0.30）和堿性磷酸酶水平（202.5±40.82）、股骨骨

22、密度（226.50±25.54）、（腰椎骨密度149.30±12.52）、骨強(qiáng)度（80.37±9.37）和骨剛度（187.10±30.06）均顯著增加，而血清磷水平（2.84±1.78）顯著降低（P＜0.05）;骨小梁數(shù)目增多，骨小梁變厚變粗，骨小梁間出現(xiàn)連接，陷窩減少;骨小梁的數(shù)量（6.42±1.24）、相當(dāng)體積(25.00±4.88)和厚度（39.63±4.16）顯著增加，而骨小梁分離度(124.72±29.79)顯著降低，單位骨小

23、梁破骨細(xì)胞數(shù)（29.52±8.38）減少（P＜0.05）。
　　 4、各種染色結(jié)果顯示β-磷酸三鈣組9w無炎癥反應(yīng);而CS硅酸鈣和Sr-CS摻鍶硅酸鈣:相對TCP有較多的成骨，但9w仍有炎癥反應(yīng)。
　　 結(jié)論：
　　 1、兩系統(tǒng)理論中的支持與儲備系統(tǒng)中含有脂肪源干細(xì)胞，并且這種干細(xì)胞是一種未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞;
　　 2、長期給予大劑量的糖皮質(zhì)激素可以模擬骨質(zhì)疏松模型;
　　 3、通過移植異體脂肪

24、源干細(xì)胞可有效改善體內(nèi)鈣、磷代謝，增加骨形成，有效預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松，為臨床上骨質(zhì)疏松的研究和治療提供了一種新的研究思路和方法;
　　 4、對“筋膜學(xué)說”中“通過動員筋膜結(jié)締組織中儲備的未分化干細(xì)胞可治療退行性疾病”提供了部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 5、不同的骨填充材料，對骨創(chuàng)傷面影響不同。新材料CS和Sr均可促進(jìn)骨形成。為臨床上骨質(zhì)疏松的研究和治療提供了一種新的研究思路和方法。
　　 綜上所述，移植異體脂肪源干細(xì)胞對

25、糖皮質(zhì)激素致骨質(zhì)疏松大鼠有一定的治療及預(yù)防作用，能夠促進(jìn)骨形成，增加骨密度，改善骨生物力學(xué)性能，增強(qiáng)骨強(qiáng)度，降低骨折的發(fā)生率。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步提示在骨質(zhì)疏松的研究中應(yīng)該更加關(guān)注提高機(jī)體干細(xì)胞的數(shù)量和促進(jìn)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化及骨組織的形成方面，為臨床上治療骨質(zhì)疏松提供了一種新的研究思路。同時(shí)，不同填充骨質(zhì)疏松骨缺損的新材料填充后骨切片對比，新材料CS和Sr均可促進(jìn)骨形成。為臨床上骨質(zhì)疏松的研究和治療提供了一種新的研究思路和方法。