基于克隆技術(shù)構(gòu)建基因修飾兔模型的研究.pdf

1、隨著越來(lái)越多的基因組序列相繼被識(shí)別，人類(lèi)對(duì)生物本質(zhì)的認(rèn)識(shí)已經(jīng)發(fā)生了重大的變化，如何利用這些基因信息來(lái)研究其功能呢？在基礎(chǔ)研究中，比較常用的方法是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因打靶技術(shù)構(gòu)建動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)行相關(guān)的研究。在生產(chǎn)基因修飾的大動(dòng)物的過(guò)程中，基于克隆技術(shù)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因打靶動(dòng)物模型的制作在醫(yī)學(xué)及基礎(chǔ)科學(xué)等領(lǐng)域的研究中處于舉足輕重的地位。
　　目前家兔已經(jīng)被廣泛用作模擬研究人類(lèi)相關(guān)疾病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，包括心血管疾病、代謝疾病、呼吸系統(tǒng)疾病

2、和各種類(lèi)型的癌癥疾病。兔具有一些優(yōu)于其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的特性:其體型能夠允許一些不能在小鼠和大鼠身上實(shí)施的手術(shù)得以實(shí)現(xiàn)，而且它們系統(tǒng)發(fā)生上更接近人類(lèi)。此外，在人類(lèi)生殖領(lǐng)域研究中，一些基因的高度保守性顯示兔將是研究人類(lèi)胚胎植入前發(fā)育的一個(gè)有價(jià)值的動(dòng)物模型，而且其胚胎和胎兒-胎盤(pán)發(fā)育與人類(lèi)相似。然而，目前僅有數(shù)量有限的轉(zhuǎn)基因兔和自然突變兔模型可供研究，因此通過(guò)基因改造獲得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型兔具有非常廣闊的應(yīng)用前景和理論價(jià)值。
　　本研究以家兔克隆

3、技術(shù)為基礎(chǔ)構(gòu)建基因修飾兔模型，分兩部分內(nèi)容:
　?。ㄒ唬┪覀儤?gòu)建了兔Oct4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)EGFP表達(dá)的一個(gè)報(bào)告質(zhì)粒(prOG)，并通過(guò)體細(xì)胞轉(zhuǎn)染和核移植技術(shù)(SCNT)獲得了prOG轉(zhuǎn)基因克隆兔。prOG轉(zhuǎn)基因胚胎和prOG轉(zhuǎn)基因兔F1代胚胎均能觀察到綠色熒光的表達(dá)，而且在27 dpc兔胎兒生殖器官也有綠色熒光的表達(dá)。之后，我們分別建立培養(yǎng)了prOG-SSCs和prOG-ES細(xì)胞系，觀察到綠色熒光的表達(dá);并且發(fā)現(xiàn)了兔ES細(xì)胞的異質(zhì)性

4、，分離兩種細(xì)胞后進(jìn)行了初步的表觀遺傳分析。prOG轉(zhuǎn)基因兔作為研究兔多能性細(xì)胞來(lái)源和維持的一個(gè)新模型，為兔多能性細(xì)胞的相關(guān)研究提供了便利，同時(shí)也可能會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)兔胚胎發(fā)生過(guò)程中的機(jī)理研究。
　?。ǘ┰谶@部分研究中，我們闡述了通過(guò)重組型腺相關(guān)病毒(rAAV)介導(dǎo)的HPRT基因同源重組打靶克隆兔的制作過(guò)程。為了提高基因的靶向效率，我們采用了基因捕獲的設(shè)計(jì)策略。通過(guò)不同的設(shè)計(jì)策略，分別建立了雄性和雌性不同類(lèi)型的基因打靶成纖維細(xì)胞系;將