自發(fā)性高血壓大鼠淋巴細(xì)胞鉀通道電流改變及其分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)研究首次采用膜片鉗技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Westernblot技術(shù)，探討自發(fā)性高血壓大鼠（sponstaneously hypertensive rat，SHR）淋巴細(xì)胞鉀通道發(fā)生的變化及其高血壓病和淋巴細(xì)胞鉀通道之間的關(guān)系，為高血壓病淋巴細(xì)胞激活狀態(tài)提供直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從細(xì)胞離子通道水平支持高血壓病的炎性發(fā)病機(jī)制。本研究包括：1）研究SHR和正常Wistar大鼠外周血淋巴細(xì)胞Kv和IKCa通道電流密度發(fā)生的變化，探討淋

2、巴細(xì)胞Kv和IKCa通道在SHR和正常Wistar大鼠之間的差異，為SHR淋巴細(xì)胞激活提供依據(jù)，探討鉀通道在高血壓病淋巴細(xì)胞激活中的作用。2）通過(guò)研究SHR和正常Wistar大鼠外周血淋巴細(xì)胞Kv1.3、KCa3.1 mRNA和蛋白表達(dá)的變化，從分子生物學(xué)角度探討淋巴細(xì)胞鉀通道和高血壓病之間的關(guān)系。3）采用膜片鉗技術(shù)觀察體外灌流替米沙坦對(duì)SHR外周血淋巴細(xì)胞Kv通道電流的阻斷作用，探討替米沙坦對(duì)SHR淋巴細(xì)胞Kv 通道的阻斷作用是否是其

3、發(fā)揮炎癥免疫調(diào)節(jié)作用參與高血壓病治療的機(jī)制之一。
　　 方法：課題第一部分：選取16周齡雄性SHR和正常Wistar大鼠各10只，使用BP-6無(wú)創(chuàng)血壓儀測(cè)量大鼠尾動(dòng)脈血壓，采集腸系膜下腔靜脈血，使用密度離心法分離SHR和正常Wistar大鼠外周血淋巴細(xì)胞，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄SHR和正常Wistar大鼠淋巴細(xì)胞上Kv和IKCa通道電流密度的變化。課題第二部分：選擇16周齡雄性SHR和正常Wistar大鼠各10只，使用密度離心

4、法分離SHR和正常Wistar大鼠外周血淋巴細(xì)胞，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和免疫印跡技術(shù)檢測(cè)SHR和正常Wistar大鼠外周血淋巴細(xì)胞Kv1.3、KCa3.1 mRNA和蛋白表達(dá)水平。課題第三部分：選擇16周齡雄性SHR大鼠，使用密度離心法分離大鼠外周血淋巴細(xì)胞，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察體外灌流不同濃度替米沙坦對(duì)SHR外周血淋巴細(xì)胞Kv通道電流的影響。
　　 結(jié)果：課題第一部分：（1）SHR淋巴細(xì)胞Kv電流密度（取自階躍電壓中

5、+60mV）為119±9.6 pA/pF（n=30），正常Wistar大鼠為56±8.5pA/pF（n=40），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（2）SHR 淋巴細(xì)胞IKCa（取自階躍電壓中+60mV）電流密度為57.75±4.50pA/pF（n=20），正常Wistar大鼠為42.75± 5.40pA/pF（n=20），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；階躍電壓為+40mV時(shí)SHR電流密度為45.40±5.61 pA/pF，正常Wi

6、star大鼠為34.40±3.60 pA/pF，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（3）SHR收縮壓與淋巴細(xì)胞Kv電流密度之間呈正相關(guān)：相關(guān)系數(shù)為r=0.837，P＜0.05；SHR收縮壓與淋巴細(xì)胞IKCa電流密度之間呈正相關(guān)：相關(guān)系數(shù)為r=0.753，P＜0.05。課題第二部分：（1）SHR 淋巴細(xì)胞Kv1.3 mRNA和蛋白表達(dá)水平高于正常Wistar大鼠（P＜0.05）；（2）與正常Wistar大鼠相比，SHR淋巴細(xì)胞KCa3.1

7、 mRNA和蛋白表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；（3）SHR收縮壓和淋巴細(xì)胞Kv1.3基因和蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.830，P＜0.05；r=0.836，P＜0.05）；（4）SHR收縮壓和淋巴細(xì)胞KCa3.1基因和蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.674，P＜0.05；r=0.714，P＜0.05）。課題第三部分：體外灌流替米沙坦呈濃度依賴性的阻斷SHR淋巴細(xì)胞Kv通道，不同濃度替米沙坦（10mmol/L、30mmol/L、

8、100mmol/L）對(duì)Kv通道的阻斷率分別為 10.5±3.4%（n=30）、45.8±3.7%（n=30）、81.6±4.2%（n=30）。在終濃度為30mmol/L、100mmol/L時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 結(jié)論：1）SHR淋巴細(xì)胞Kv和IKCa通道電流密度增加，提示在SHR淋巴細(xì)胞表面存在更多有功能的Kv和IKCa通道，說(shuō)明Kv和IKCa通道在調(diào)節(jié)SHR淋巴細(xì)胞激活中起著關(guān)鍵性的作用。2）SHR淋巴細(xì)