Apelin在正常妊娠及妊娠期高血壓疾病胎盤組織中的表達(dá)及其與一氧化氮關(guān)系的研究.pdf

1、研究背景：
　　 本課題選擇胎盤為研究對象，采用免疫組織化學(xué)方法和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(熒光定量RT-PCR)檢測Apelin、APJ在絨毛及胎盤組織中的表達(dá)、硝酸還原酶法檢測胎盤組織NO的水平，分光光度法測定胎盤組織中NOS的活性。探討Apelin在妊娠期高血壓疾病中的作用及其與NO之間的關(guān)系。并采用Apelin-36對體外培養(yǎng)的胎盤絨毛進(jìn)行干預(yù)，觀察Apelin對胎盤絨毛NO-NOS的影響，以期為妊娠期高血壓疾病的防治提

2、供新的思路。
　　 本研究內(nèi)容包括三部分，現(xiàn)概述如下：
　　 第一部分 Apelin及受體APJ在正常妊娠早孕絨毛和晚孕胎盤及臍血管組織中的表達(dá)及定位研究
　　 目的：探討血管活性肽Apelin及其受體APJ在早期妊娠絨毛、晚期妊娠胎盤及臍血管組織中的表達(dá)和定位。
　　 方法：分別取10例妊娠7～9周婦女(早孕組)的絨毛組織和15例妊娠37～41周(晚孕組)婦女的胎盤及臍帶組織，采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合

3、酶鏈反應(yīng)法(熒光定量RT-PCR)及免疫組織化學(xué)染色分析法(SP)檢測兩組孕婦胎盤Apelin及其受體APJ mRNA和蛋白的表達(dá)情況，并用高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)(HPIAS-1000)對其進(jìn)行定量分析。同時用免疫組織化學(xué)染色分析法觀察Apelin-36及其受體APJ在正常妊娠臍帶血管組織中的定位表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：(1)熒光定量RT-PCR 結(jié)果顯示，晚孕組胎盤絨毛組織Apelin mRNA水平顯著高于早孕組絨毛組織(P

4、<0.05),而APJ mRNA在不同妊娠期絨毛組織中的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。(2)免疫組化研究結(jié)果顯示，Apelin-36在早孕絨毛組織中的表達(dá)部位為絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞及細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞，少數(shù)間質(zhì)細(xì)胞中也可見到Apelin-36弱陽性表達(dá);在晚孕胎盤組織中,主要表達(dá)于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞，部分血管內(nèi)皮細(xì)胞及少數(shù)間質(zhì)細(xì)胞也可見到Apelin-36的陽性表達(dá)，陽性染色主要位于胞漿。APJ蛋白在早孕絨毛組織及晚孕胎盤組織的表達(dá)主要位于合體滋養(yǎng)

5、細(xì)胞及細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞，其次表達(dá)的部位為血管內(nèi)皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞，少數(shù)血管平滑肌細(xì)胞中也有APJ的表達(dá)，陽性染色主要位于胞核。(3)彩色圖文分析系統(tǒng)結(jié)果顯示，Apelin-36在早孕絨毛組織中表達(dá)較弱，而在晚孕胎盤組織中陽性表達(dá)明顯增強,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.01),受體APJ在早孕組與晚孕組間的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)。(4)免疫組化研究結(jié)果顯示，Apelin-36及受體APJ蛋白在臍靜脈血管內(nèi)皮均有陽性表達(dá),在臍動脈血

6、管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)則明顯減弱。在臍血管平滑肌組織中，受體APJ散在表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞周圍的平滑肌細(xì)胞中，未發(fā)現(xiàn)Apelin-36的陽性表達(dá)。
　　 結(jié)論：正常早孕絨毛及晚孕胎盤組織中有Apelin及其受體APJ的表達(dá)，即胎盤組織內(nèi)存在Apelin-APJ體系的自分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)，晚孕期胎盤組織Apelin mRNA轉(zhuǎn)錄水平增高,可能與妊娠晚期胎盤血流灌注量的需求增加有關(guān)。在晚期妊娠的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中，Apelin-36及受體APJ均

7、呈陽性表達(dá)，臍動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞則表達(dá)減弱，這種表達(dá)的差異性，可能是由于妊娠晚期臍靜脈較臍動脈內(nèi)皮含有更豐富的活性物質(zhì)，以適應(yīng)胎兒生長發(fā)育的需要。
　　 第二部分 Apelin與妊娠期高血壓疾病發(fā)病及NO關(guān)系的研究
　　 目的：檢測血管活性肽Apelin及其受體APJ在正常妊娠和妊娠期高血壓疾病(HDCP)患者胎盤組織中的表達(dá)，探討Apelin在妊娠期高血壓疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用及其與一氧化氮(NO)的關(guān)系。
　　

8、 方法：選擇孕周為36～41周的妊娠期高血壓疾病患者36例，其中妊娠期高血壓10例,輕度子癇前期11例,重度子癇前期15例;選擇同期正常孕婦15例作為對照組。采用免疫組織化學(xué)染色分析法檢測兩組孕婦胎盤組織中Apelin-36及受體APJ的表達(dá)，熒光定量RT-PCR檢測Apelin及APJmRNA的表達(dá)。硝酸還原酶法檢測胎盤組織NO的水平，分光光度法測定胎盤組織中NOS的活性，
　　 結(jié)果：(1)妊娠期高血壓疾病組胎盤組織Apel

9、in-36及受體APJ在表達(dá)部位上與對照組(正常晚孕組)無明顯差異，主要表達(dá)的部位為絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞及細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞。(2)妊娠期高血壓疾病組胎盤Apelin mRNA及Apelin-36的表達(dá)量顯著低于對照組(P<0.01),且隨著病情程度的加重，各組胎盤中Apelin mRNA及Apelin-36的表達(dá)水平呈下降的趨勢，輕度、重度子癇前期胎盤Apelin mRNA及Apelin-36的表達(dá)水平均顯著低于妊娠期高血壓組(P<0.01,P

10、<0.01)，輕、重度子癇前期兩組之間Apelin mRNA及Apelin-36的表達(dá)水平比較，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(3)妊娠期高血壓疾病各組胎盤組織APJmRNA及蛋白水平的表達(dá)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。(4)妊娠期高血壓疾病組胎盤組織NO水平與對照組相比顯著降低(P<0.01)，且隨著病情程度的加重，各組胎盤組織中NO水平呈下降的趨勢,輕度、重度子癇前期組胎盤組織NO水平均低于妊娠期高血壓組(P<

11、0.01，P<0.01)，輕、重度子癇前期兩組之間比較，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。妊娠期高血壓組胎盤組織NO水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。(5)妊娠期高血壓疾病組胎盤組織NOS水平與對照組相比顯著降低(P<0.01)，且隨著病情程度的加重，各組胎盤組織中NOS水平呈下降的趨勢，妊娠期高血壓疾病組輕度、重度子癇前期胎盤組織NO水平均低于妊娠期高血壓組(P<0.05)，妊娠期高血壓組胎盤組織NO水平與對照組

12、比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。(6)妊娠期高血壓疾病組胎盤組織NO水平及NOS活性與Apelin mRNA水平呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.823,0.901(P＜0.01，P＜0.01)。
　　 結(jié)論：(1)血管活性肽Apelin及其受體APJ在妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織中均有表達(dá)，妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織中Apelin mRNA及Apelin-36表達(dá)水平低下，并與病情程度相關(guān)，可能在妊娠期高血壓疾病的發(fā)病中起

13、重要作用。(2)妊娠期高血壓疾病組胎盤組織NO水平及NOS活性顯著降低，與胎盤組織Apelin mRNA 表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系，提示胎盤組織Apelin水平下降,NOS活性低下,使NO合成下降，進(jìn)一步加重胎盤缺血缺氧，促進(jìn)妊娠期高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展。
　　 第三部分 Apelin-36 對胎盤絨毛NOS活性、NO及β-HCG分泌的影響
　　 目的：探討Apelin 對胎盤絨毛NOS活性和NO生成的影響。
　　 方

14、法：體外培養(yǎng)正常足月胎盤絨毛，用血管緊張素(AngⅡ)及不同濃度的Apelin-36作用于胎盤絨毛，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定胎盤絨毛培養(yǎng)液中β-HCG水平，硝酸還原酶法檢測胎盤絨毛NO的水平，分光光度法測定胎盤絨毛NOS的活性。
　　 結(jié)果：Apelin-36各組絨毛培養(yǎng)上清液β-hCG水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，即Apelin-36對足月妊娠胎盤絨毛分泌β-hCG無影響。加入Ap

15、elin培養(yǎng)的各組絨毛NO水平較對照組均明顯升高(P＜0.01),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與10ng/ml Apelin組比較，50ng/ml及250ng/ml Apelin兩組的NO水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。50ng/ml及250ng/ml Apelin兩組之間的NO水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。加入Apelin培養(yǎng)的各組絨毛總NOS (tNOS)活性較對照組均明顯升高(P＜0.01)，其中主要是內(nèi)皮型NOS

16、(eNOS)活性的升高，各濃度組均有升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),而誘導(dǎo)型NOS (iNOS))活性無明顯改變 (P＞0.05)。與對照組比較，AngⅡ可顯著減少胎盤絨毛NO水平 (P<0.01),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在AngⅡ作用基礎(chǔ)上，分別加入10ng/ml Apelin，250ng/ml Apelin后，可見Apelin促進(jìn)NO 釋放，其中250ng/ml Apelin抑制AngⅡ的作用更明顯(P<0.01)。