非小細胞肺癌相關(guān)多肽IgY抗體的制備及其ELISA檢測研究.pdf

1、肺癌是當前世界各國常見的惡性腫瘤之一，是目前全球發(fā)病率、死亡率都很高的肺部惡性腫瘤疾病。其中80％是非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)。肺癌早期診斷困難。80％的肺癌患者就診時已屬晚期，失去了手術(shù)根治的機會，放療化療效果不佳，5年生存率不到15％;而早期（IA期）肺癌手術(shù)后5年生存率達70％，但肺癌早期確診率只有約15％，因此肺癌總的預后不良與肺癌缺乏有效的早期診斷手段有關(guān)。前期蛋白質(zhì)組學研

2、究利用表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry，SELDI-TOF-MS）技術(shù)篩選了兩個具有較高特異度和靈敏度的肺癌早期血清特異蛋白，本研究擬對前期成果進行二次開發(fā)。
　　 多肽(peptide)是分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物，它由氨基酸組成，是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的片段，

3、具有很強的生物活性。利用人工合成多肽技術(shù)，采用化學合成法原理，并采用合成-檢測-合成的方式，在自動多肽合成儀上合成兩條多肽，兩條多肽分別是從兩個肺癌特異蛋白序列中分析篩選出的，質(zhì)譜檢測保證合成序列的正確性，最后進行HPLC純化。將兩條多肽偶聯(lián)鑰孔戚血藍素KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)作為抗原，以雞作為實驗對象，免疫制備IgY多克隆抗體抗體。IgY(eggyolk immunoglobulin)即從卵

4、黃中提取的抗體，雞為了保護后代，將血清中的抗體轉(zhuǎn)移到卵黃中，卵黃抗體的沉降系數(shù)為7S，分子量16-18萬，含糖約2.5％，與哺乳動物的IgG有所不同，被稱為IgY。由2個亞基組成，重鏈67000-70000，輕鏈22000-30000。保守的哺乳動物蛋白對于系統(tǒng)進化遠距離的鳥類可以產(chǎn)生更好的免疫原性。福氏完全佐劑與抗原等體積混合，充分乳化，水稀釋-辛酸法結(jié)合硫酸銨沉淀法分離提取IgY，親和層析進一步純化特異性IgY，間接非競爭酶聯(lián)免疫吸

5、附法檢測抗體效價，棋盤滴定法選擇ELISA的最適工作條件。將抗64AA肽IgY抗體(Ab1)和抗36AA肽IgY抗體(Ab2)聯(lián)合，用ELISA法檢測肺癌血清樣本96例，正常人樣本102例。結(jié)果成功制備了非小細胞相關(guān)多肽IgY抗體，Ab1效價為1:104，Ab2效價為1:105，用Ab1和Ab2組合做聯(lián)合檢測，以臨界值0.241為陽性判斷標準，96例肺癌患者血清中，陽性58例，敏感度為60.4％,102例正常人血清中，陽性19例，特異度