他汀和揮發(fā)性麻醉劑類藥物對機(jī)體缺血再灌注損傷的作用及其機(jī)制探討.pdf

1、目的：
　　缺血再灌注損傷（Ischemia Reperfusion Injury，IRI）是指缺血組織或器官重新獲得血流灌注或氧供應(yīng)后對組織和器官等產(chǎn)生的損傷作用。目前，采用預(yù)處理和后處理作用可減輕缺血再灌注造成的組織損傷。預(yù)處理是指短暫性缺血發(fā)作可降低隨后嚴(yán)重的缺血所導(dǎo)致的損害的現(xiàn)象，后處理指在再灌注早期實(shí)施短暫的再缺血可以減少一些重要器官包括腦和心臟的缺血性損傷。應(yīng)用相對安全的藥物進(jìn)行預(yù)處理和后處理可以簡化這種保護(hù)形式并可能

2、擁有廣泛的應(yīng)用前景，即藥物的預(yù)處理及后處理。他汀是戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，臨床上常用來降低血膽固醇水平，除了減低膽固醇外，他汀類藥物還有多種其他作用，例如，它可以用作減輕骨質(zhì)疏松，減慢腫瘤生長，同時(shí)可以提高心衰患者的心室功能;異氟烷為臨床上常用的揮發(fā)性麻醉劑藥物，應(yīng)用異氟烷可以減少鼠的腦缺血損害，而其他揮發(fā)性麻醉藥物是否可以誘導(dǎo)腦的預(yù)處理和后處理效果及誘導(dǎo)腦神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制仍不清楚。本研究擬采用他汀類藥物辛伐他汀、阿托伐他汀和揮發(fā)性

3、麻醉劑異氟烷、七氟烷、地氟烷對缺血再灌注損傷內(nèi)皮細(xì)胞、類人神經(jīng)細(xì)胞和腦組織進(jìn)行預(yù)處理和后處理作用，觀察他汀類和揮發(fā)性麻醉劑類藥物對缺血再灌注損傷的影響，并探討其可能的保護(hù)機(jī)制。
　　方法：
　　1、他汀類藥物后處理對內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注損傷的影響
　　對牛肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞(bovine pulmonary artery endothelial cells，BPAEC)進(jìn)行氧糖剝奪（oxygen-glucose depriv

4、ation，OGD）和再灌注處理，在再灌注之初將不同劑量的他汀類藥物[辛伐他?。?.5、1、2、4、10μM）和阿托伐他汀(0.5、1、2、4、10μM)]加入牛肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞中進(jìn)行后處理作用，同時(shí)分別添加相應(yīng)的抑制劑 diphenyleneiodonium（DPI，20μM）、Geranylgeranyl pyrophosphate（GGPP，10、20和40μM）、mevalonate(200和500μM)、Akt的抑制劑Ly294

5、002(10μM)、ERK的抑制劑U0126(1μM)，觀察不同劑量辛伐他汀和阿托伐他汀后處理組、氧糖剝奪再灌注組、抑制劑添加組及對照組細(xì)胞中乳酸脫氫酶(Lactatedehydrogenase，LDH)的釋放水平、過氧化物產(chǎn)物生成和ERK蛋白、ERK磷酸化蛋白p-ERK、Akt蛋白、Akt磷酸化蛋白p-Akt的表達(dá)情況。
　　2、揮發(fā)性麻醉劑后處理對缺血再灌注類人神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用
　　采用維甲酸誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞（人

6、成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系）使其分化為最終的類人神經(jīng)細(xì)胞。對誘導(dǎo)后的SH-SY5Y類人神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪再灌注處理，于再灌注早期應(yīng)用異氟烷、七氟烷和地氟烷進(jìn)行后處理作用。測量各組細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)的釋放以確定細(xì)胞損傷程度，檢測GSK3β(Ser9)、GSK3β第9位絲氨酸磷酸化蛋白p-GSK3β(Ser9)的蛋白表達(dá)水平，探討揮發(fā)性麻醉劑異氟烷對類人神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制。
　　3、異氟烷預(yù)處理與后處理對腦缺血再灌注的作用研究

7、r>　　實(shí)驗(yàn)分組為對照組、大腦中動脈阻塞(middle cerebral arterial occlusion，MCAO)再灌注組、異氟烷預(yù)處理+MCAO組和異氟烷后處理+MCAO組。大腦中動脈阻塞再灌注組為阻塞成年雄性大鼠右側(cè)大腦中動脈血液供應(yīng)90 min。異氟烷預(yù)處理+MCAO組為在大腦缺血之前24 h使動物接觸2％異氟烷30 min，異氟烷后處理+MCAO組是在大腦缺血后立即使動物接觸2％異氟烷60 min，對腦細(xì)胞和外周血中白細(xì)

8、胞進(jìn)行免疫染色和流式細(xì)胞分析，對各組大鼠血清中SOD活性、MDA含量進(jìn)行檢測，對血清中炎癥因子IL-1β和TNF-α含量進(jìn)行檢測;同時(shí)，采用real-timePCR和Western blot方法檢測大鼠缺血再灌注組織中MMP-2、MMP-9、claudin-5、occludin的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、他汀類藥物后處理可減輕內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注損傷
　　他汀類藥物劑量依賴地降低了氧糖剝奪和再灌注所導(dǎo)

9、致的乳酸脫氫酶的釋放，加入戊二酰輔酶A還原酶抑制劑GGPP、甲羥戊酸和Akt的抑制劑Ly294002可以逆轉(zhuǎn)或消除他汀后處理的保護(hù)作用，但加入ERK抑制劑U0126卻無此效應(yīng)，說明辛伐他汀和阿托伐他汀提高了缺血再灌注牛肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞中Akt磷酸化/Akt活化的表達(dá)但不能改變ERK磷酸化/ERK活化的表達(dá)。同LDH釋放數(shù)據(jù)相一致，他汀后處理抑制過氧化物的作用可被GGPP消除，氧糖剝奪和再灌注誘導(dǎo)的過氧化物產(chǎn)生及細(xì)胞損傷也可以被黃素酶抑制劑

10、二聯(lián)苯碘抑制。
　　2、揮發(fā)性麻醉劑后處理可對缺血再灌注類人神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用
　　應(yīng)用異氟烷、七氟烷、地氟烷進(jìn)行后處理可減少氧糖剝奪后再灌注導(dǎo)致的乳酸脫氫酶釋放及細(xì)胞損傷。在再灌注的0h和1h應(yīng)用2％異氟烷時(shí)，這種保護(hù)效果更為明顯。異氟烷可在OGD后顯著增加GSK3β9位絲氨酸的磷酸化，同時(shí)，抑制GSK3β可減少OGD誘導(dǎo)的LDH的釋放。
　　3、異氟烷預(yù)處理與后處理對腦缺血再灌注所導(dǎo)致的細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響

11、　　腦缺血再灌注可增加缺血大腦半球中活化的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，經(jīng)過異氟烷預(yù)處理或后處理后，其增加作用則不明顯。腦缺血再灌注對外周血中的中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞百分比并無顯著性影響;異氟烷預(yù)處理和后處理可降低缺血再灌注導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)及脂質(zhì)過氧化損傷，并可降低MMP-2和MMP-9對緊密連接蛋白claudin-5和occludin的蛋白水解活性，減少緊密連接蛋白的缺失，從而減輕缺血再灌注損傷。
　　結(jié)論：
　　他汀類