β-欖香烯對大鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞分化及分化過程中Notch信號通路的影響.pdf

1、內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cell，EPC）是一類參與循環(huán)增殖并能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，EC），但還未能表達(dá)成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞表型、也未形成微血管的前體細(xì)胞。胎兒出生后，EPC主要定居于骨髓。隨著對EPC研究的深入，越來越多的證據(jù)表明EPC在腫瘤血管生成中起到重要作用。EPC分化為內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell，EC）是其功能發(fā)揮過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　

2、 目前對EPC分化的研究主要從形態(tài)和細(xì)胞表面標(biāo)志兩方面入手。在形態(tài)學(xué)無法將EPC與其他細(xì)胞區(qū)分開來，所以主要靠分子標(biāo)志識別。CD133是新近發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞標(biāo)記，不表達(dá)于成熟EC，被認(rèn)為是目前區(qū)分血管EPC與EC的最主要標(biāo)記[1，2]。vWF（von Willebrand因子）貯存在EC的Weibel-Palade小體中，血漿中vWF絕大部分系由EC分泌，它是血管內(nèi)皮的分子標(biāo)志物。研究結(jié)果表明，純化的CD133+細(xì)胞在體外能分化為EC。在分

3、化過程中，EPC明顯失去CD133，并開始表達(dá)成熟EC特有的表面標(biāo)志，如vWF。
　　 Notch信號通路是進(jìn)化過程中保守的信號通路，在決定細(xì)胞命運(yùn)和模型建立中起到關(guān)鍵的作用[3-6].胚胎發(fā)育中，Notch信號通路是神經(jīng)系統(tǒng)，心血管系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)，肝臟和腎臟發(fā)育中的關(guān)鍵信號。成年后，Noah通路涉及組織再生和干細(xì)胞功能的發(fā)揮[7-9]。
　　 β-欖香烯是從姜科植物溫郁金（溫莪術(shù)）的根莖中提取的抗癌有效成分，溫莪術(shù)在祖

4、國醫(yī)學(xué)中有行氣破血，消積止痛、抗腫瘤的功效，它在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、分化、抗腫瘤轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性、降低腫瘤微血管密度等諸多方面都發(fā)揮著顯著的作用[10-11]。目前，臨床上主要將欖香烯乳劑應(yīng)用于惡性漿膜腔積液、肺癌、消化道腫瘤、腦瘤以及其他淺表性腫瘤的化療，對白血病、惡性淋巴瘤、食管癌、胃癌、乳腺癌亦有一定療效。但其對EPC分化過程的影響尚待進(jìn)一步研究。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 一、大鼠骨髓來源的EPC分離、培養(yǎng)

5、及鑒定
　　 應(yīng)用梯度密度離心法從大鼠骨髓中分離單個(gè)核細(xì)胞，接種于內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中，經(jīng)血管內(nèi)皮生長因子（1μg/μ1 VEGF）誘導(dǎo)后，進(jìn)行細(xì)胞特異性標(biāo)記物CD133、vWF相關(guān)抗原檢測，鑒定其為內(nèi)皮祖細(xì)胞。
　　 二、EPC分化過程N(yùn)otch信號通路的活化情況
　　 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法檢測不同培養(yǎng)時(shí)間（0天、4天、7天、10天、14天）EPC中Notch信號通路靶基因Hey-2、Hes-

6、1的表達(dá)情況。
　　 三、β-欖香烯對EPC分化及EPC分化過程中Notch信號通路的影響
　　 （1）以不同濃度β-欖香烯（0μ9/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml）干預(yù)培養(yǎng)4天和7天的EPC，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法檢測EPC表面抗原CD133、vWF的表達(dá)情況。
　　 （2）以不同濃度β-欖香烯（0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml）干預(yù)培養(yǎng)7天的E

7、PC，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法檢測Notch信號通路中靶基因Hey-2及Hes-1的表達(dá)情況。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、EPC的培養(yǎng)與鑒定
　　 原代培養(yǎng)24h后，細(xì)胞大部分呈小圓形；差速貼壁篩選后，培養(yǎng)1d可見少量細(xì)胞貼壁；4d后細(xì)胞開始伸展成梭形或紡錘形；7d有細(xì)胞集落形成，梭形細(xì)胞繼續(xù)保持貼壁狀態(tài)，生長旺盛；大約14d融合成內(nèi)皮細(xì)胞單層典型的鋪路石樣形態(tài)。CD133、vWF雙陽性熒光染

8、色為正在分化的EPC。
　　 二、EPC分化過程中Notch信號通路的活化情況
　　 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法檢測不同培養(yǎng)時(shí)間（0天、4天、7天、10天、14天）EPC中Notch信號通路靶基因Hey-2、Hes-1的表達(dá)情況。Hey-2、Hes-1在0天時(shí)無表達(dá)，4天有弱表達(dá)，7天、10天、14天表達(dá)逐漸增強(qiáng)，對灰度值的相對比值進(jìn)行分析表明，p<0.05。
　　 三、β-欖香烯對EPC分化及E

9、PC分化過程中Notch信號通路的影響
　　 1、β-欖香烯對EPC分化的影響在培養(yǎng)4天和7天的EPC培養(yǎng)液中加入不同濃度β-欖香烯（0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml），作用24小時(shí)后，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法檢測EPC表面抗原CD133和vWF的表達(dá)情況。結(jié)果表明，隨著β-欖香烯濃度的增加，CD133表達(dá)逐漸增加，vWF表達(dá)逐漸減弱。對灰度值的相對比值進(jìn)行分析表明，p<0.01。

10、r>　　 2、β-欖香烯對EPC分化過程中Notch信號通路的影響 在培養(yǎng)7天的EPC培養(yǎng)液中加入不同濃度β-欖香烯（0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml），作用24小時(shí)后，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法檢測Notch信號通路中靶基因Hey-2和Hes-1的表達(dá)情況。結(jié)果表明，隨著β-欖香烯濃度的增加，Hey-2和Hes-1的表達(dá)逐漸減弱。對灰度值的相對比值進(jìn)行分析表明，p<0.01
　　 結(jié)