TRPA1通道整流的決定因素及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:觀察鈣離子，鎂離子對非選擇性陽離子通道(TRPA1)以及單點(diǎn)突變對通道(L906C)整流的影響，進(jìn)一步探討TRPA1整流的分子機(jī)制。為TRPA1的深入研究作進(jìn)一步探討。
　　方法:通過單點(diǎn)突變將L906亮氨酸突變?yōu)榘牍獍彼?，?jīng)PCR擴(kuò)增，測序正確的產(chǎn)物轉(zhuǎn)染到大腸桿菌中表達(dá)，然后提取通道質(zhì)粒。將單點(diǎn)突變后的通道質(zhì)粒與攜帶綠色熒光蛋白的質(zhì)粒按照9∶1共轉(zhuǎn)到HEK293細(xì)胞中表達(dá)24-36小時后，再進(jìn)行電生理檢測，實(shí)驗(yàn)過程中采用A

2、ITC使通道激活。通過替換細(xì)胞內(nèi)外的二價陽離子（鈣離子和鎂離子）觀察二價陽離子對通道電流和電容的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)野生型TRPA1上位于通道蛋白離子選擇性區(qū)域的L906單點(diǎn)突變?yōu)榘腚装彼岷?，通道整流方向發(fā)生了翻轉(zhuǎn)。野生型為外向整流通道，L906C翻轉(zhuǎn)為內(nèi)向整流通道。野生型TRPA1和單點(diǎn)突變型L906C在-100mV和+100mV電壓下，所測電流比值分別為0.47±0.07(n=7)和3.25±0.11(n=4)

3、。
　　(2)二價陽離子（Ca2+和Mg2+）對TRPA1野生型和L906C單點(diǎn)突變型通道的整流有增強(qiáng)作用。但二價陽離子(Ca2+和Mg2+)不能改變通道的整流方向。
　　(3) L906C單點(diǎn)突變型在正電壓下時呈電壓和時間依賴性的失活。
　　(4) TRPA1抑制劑HC030031和釕紅(RR)在單點(diǎn)突變L906C上的抑制效應(yīng)曲線較TRPA1野生型右移。
　　結(jié)論:
　　單點(diǎn)突變L906C使通道外向整流特