前列腺癌異常表達(dá)microRNAs的篩選及miRNA-182作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、前列腺癌是老年男性常見的惡性腫瘤，前列腺癌的預(yù)后與前列腺癌的治療方式有很大關(guān)系。雖然包括手術(shù)、內(nèi)分泌治療、放化療和生物治療等傳統(tǒng)的治療手段，對于局限性前列腺癌有很好的療效。但是對于轉(zhuǎn)移性前列腺癌的治療仍然是一個(gè)世界難題。因此，探索前列腺癌浸潤及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找新的前列腺癌的治療靶點(diǎn)是目前前列腺癌治療研究的重點(diǎn)。miRNAs是一類內(nèi)生的、長度約19-25個(gè)核苷酸的ncRNA，其在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。成熟的microRNA通過

2、與mRNA的3’端UTR部分互補(bǔ)識別引起特定的靶mRNA沉默。隨著miRNA調(diào)控基因表達(dá)的研究的逐步深入，越來越多的證據(jù)表明，miRNA可以調(diào)控那些與發(fā)育、增殖、凋亡及應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因，對細(xì)胞自身穩(wěn)定和發(fā)育起著重要作用，而且它們的表達(dá)異常是人類惡性腫瘤的一個(gè)共同特征。miRNA在包括前列腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。但是miRNAs在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用的研究近幾年才剛剛起步。并且，隨著大量新的miRN

3、As被發(fā)現(xiàn)，這些新miRNAs在前列腺癌中的表達(dá)也需要被及時(shí)檢測與分析。
　　第一部分前列腺癌差異表達(dá)miRNAs的篩選
　　目的篩選前列腺癌差異表達(dá)miRNAs。
　　方法收集了2010年1月至2012年12月期間手術(shù)切除的前列腺癌標(biāo)本5例、良性前列腺增生標(biāo)本3例。首先運(yùn)用目前最新版的miRNAs生物芯片技術(shù)篩選出前列腺癌的差異表達(dá)miRNAs，然后運(yùn)用RT-PCR方法驗(yàn)證了芯片結(jié)果。最終選出最有可能與前列腺癌增殖、

4、轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA，作為進(jìn)一步研究的對象。
　　結(jié)果通過miRNAs芯片分析和RT-PCR驗(yàn)證，我們共發(fā)現(xiàn)前列腺癌中差異表達(dá)miRNA27個(gè)，其中表達(dá)下調(diào)的miRNA5個(gè)(miR-345，miR-145，miR-221，miR-27b和miR-378)，表達(dá)上調(diào)的miRNA22個(gè)，其中miR-182的表達(dá)相比良性前列腺增生組織明顯升高。
　　結(jié)論前列腺癌組織中存在著差異表達(dá)miRNAs，其中miR-182在前列腺癌組織中的

5、表達(dá)明顯升高。因此，下一步將進(jìn)一步研究miR-182在前列腺癌中的作用。
　　第二部分前列腺癌異常表達(dá)miRNAs功能研究
　　目的探討miRNA-182在前列腺癌增殖、凋亡、細(xì)胞侵襲方面的作用。
　　方法用RT-PCR方法檢測人正常前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1和四種前列腺癌細(xì)胞系（PC-3，DU145，22Rv1和LNCaP）中miRNA-182的表達(dá)，為了研究此miRNA在前列腺癌中的作用，我們合成了miRNA m

6、imics和miRNAinhibitros，并通過Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染前列腺癌PC-3細(xì)胞系，RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后miRNA-182表達(dá)的變化，MTT檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后PC-3細(xì)胞增殖能力變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測PC-3細(xì)胞周期及凋亡的變化;Transwell檢測PC-3細(xì)胞侵襲能力的變化。從而探討異常表達(dá)的miRNA-182在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。
　　結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)miRNA-182在這四種前列腺癌細(xì)胞系中的

7、表達(dá)均高于正常前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1，并且PC-3細(xì)胞系中miRNA-182表達(dá)上調(diào)最明顯，因此我們選擇PC-3細(xì)胞系用于進(jìn)一步研究。利用Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染miRNA-182 mimics和miRNA-182 inhibitor及其陰性對照至PC-3細(xì)胞系后，RT-PCR檢測結(jié)果顯示miRNA-182 mimics和miRNA-182 inhibitor能明顯上調(diào)及下調(diào)miRNA-182的表達(dá)水平，達(dá)到進(jìn)一步研究

8、的要求。MTT實(shí)驗(yàn)檢測PC-3細(xì)胞的增殖能力發(fā)現(xiàn)，上調(diào)PC-3細(xì)胞中的miRNA-182表達(dá)，能明顯提高細(xì)胞的增殖能力(P＜0.05），相反下調(diào)PC-3細(xì)胞中miRNA-182表達(dá)水平，細(xì)胞的增殖能力受到抑制(P＜0.05）;上調(diào)PC-3細(xì)胞中miRNA-182的表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞從G0-G1期進(jìn)入S期，相反下調(diào)PC-3細(xì)胞中miRNA-182表達(dá)，細(xì)胞在G0-G1明顯阻滯，并伴隨S期細(xì)胞的顯著減少;轉(zhuǎn)染miRNA-182 mimics后

9、PC-3細(xì)胞的凋亡率明顯低于miRNA-182 mimics對照組，相反，轉(zhuǎn)染miRNA-182 inhibitor后PC-3細(xì)胞的凋亡率要顯著高于miRNA-182 inhibitor對照組;將miRNA-182mimics和miRNA-182 inhibitor及其對照轉(zhuǎn)染入PC-3細(xì)胞后，利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測其侵襲能力的變化，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-182 mimics后細(xì)胞的侵襲能力明顯高于對照組，而轉(zhuǎn)染miRNA-

10、182 inhibitor細(xì)胞的侵襲能力明顯下降。
　　結(jié)論 miR-182在前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)明顯高于正常前列腺上皮細(xì)胞，并且前列腺癌PC-3細(xì)胞中miR-182表達(dá)差異最明顯。miR-182能促使PC-3細(xì)胞由G0-G1期進(jìn)入S期，并通過抑制PC-3細(xì)胞的早期凋亡促進(jìn)細(xì)胞的增殖。上調(diào)PC-3細(xì)胞中miR-182的表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞的侵襲。
　　第三部分前列腺癌差異表達(dá)miRNAs靶基因研究
　　目的預(yù)測miR-182的

11、可能靶基因，并驗(yàn)證其作用靶點(diǎn)，闡明miR-182的分子作用機(jī)制。
　　方法利用生物信息學(xué)技術(shù)如TargetScan，miRBase和PicTar等優(yōu)秀數(shù)據(jù)庫，預(yù)測miRNA可能的靶基因，然后利用Westem blot和熒光素酶雙報(bào)告基因檢測驗(yàn)證預(yù)測靶基因的準(zhǔn)確性。從而探明miRNA-182在前列腺癌中可能的分子作用機(jī)制。
　　結(jié)果利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測miR-182的可能靶基因?yàn)镹DRG1。WesternBlot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示

12、轉(zhuǎn)染miRNA-182 mimics組細(xì)胞的NDRG1蛋白含量明顯低于miRNA-182 mimics-NC組，轉(zhuǎn)染miRNA-182 inhibitor組細(xì)胞中NDRG1蛋白含量顯著高于miRNA-182 inhibitor-NC組;我們成功合成了pmirGLO/NDRG2-UTR載體系統(tǒng)，并將pmirGLO/NDRG1-UTR載體與miRNA-182 mimics、miRNA-182 inhibitor共轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)

13、染miRNA-182 mimics上調(diào)miRNA-182的表達(dá)能明顯抑制pmirGLO/NDRG1-UTR的熒光素酶活性，相反，轉(zhuǎn)染miRNA-182 inhibitor下調(diào)miRNA-182的表達(dá)，pmirGLO/NDRG1-UTR的熒光素酶活性增強(qiáng)。
　　結(jié)論 miR-182是通過直接與NDRG13'UTR區(qū)結(jié)合后下調(diào)NDRG1的表達(dá)，從而促進(jìn)前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖及侵襲的。miR-182可以作為一種新的前列腺癌基因治療的