Cb1-b調(diào)節(jié)RANKL-RANK通路介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤。在我國(guó),乳腺癌發(fā)病率正以每年3％的速度遞增,是發(fā)病率增長(zhǎng)最快的腫瘤。骨是乳腺癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移部位,晚期乳腺癌患者約65％-75％將發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移導(dǎo)致骨痛、骨折等骨相關(guān)事件,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。但是,迄今為止,臨床上對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的預(yù)防尚無(wú)有效的方法,主要是因其機(jī)制還未明確。因此,研究乳腺癌骨轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)認(rèn)識(shí)乳腺癌生物學(xué)性質(zhì)和研發(fā)新的分子靶向藥物具有重要意義。
　　 研

2、究證實(shí),細(xì)胞核因子kB受體活化因子配體RANKL(receptor activator ofNFkB Ligand;又名TRANCE)具有很強(qiáng)的趨化因子樣作用。RANKL是腫瘤壞死因子家族成員,通常表達(dá)于成骨細(xì)胞/骨基質(zhì)細(xì)胞表面,其受體RANK表達(dá)于破骨細(xì)胞表面。RANKL與RANK結(jié)合后,促進(jìn)破骨細(xì)胞的活化。最新研究發(fā)現(xiàn),RANK在惡性黑色素瘤細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞表面也過(guò)表達(dá)。RANKL使RANK表達(dá)陽(yáng)性的惡性黑色素瘤細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的遷

3、移功能增強(qiáng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),RANKL使RANK表達(dá)陽(yáng)性的惡性黑色素瘤細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)。但RANKL對(duì)RANK表達(dá)陰性的腸癌細(xì)胞的遷移功能和骨轉(zhuǎn)移能力并無(wú)影響。上述結(jié)果強(qiáng)烈提示,RANKL/RANK通路在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要作用。
　　 關(guān)于RANKL/RANK信號(hào)傳導(dǎo)通路,國(guó)外研究證實(shí):RANKL與RANK結(jié)合后,活化的RANK與TRAFs和Gab2(Grb2相關(guān)結(jié)合蛋白2)等形成蛋白復(fù)合體,該復(fù)合體協(xié)同酪氨酸蛋白

4、激酶Syk激活下游的Rac、MAPKs和PI3K等信號(hào)通路,促進(jìn)破骨細(xì)胞的遷移及活化,同時(shí),C-src與FAK也參與破骨細(xì)胞的成熟與分化,而文獻(xiàn)報(bào)道,Gab2,C-src與FAK均與乳腺癌的增殖、粘附、遷移等密切相關(guān)。但是在RANKL誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移過(guò)程中,Gab2,c-src與FAK是否也存在活化而發(fā)揮作用,尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 RANKL/RANK通路受泛素-蛋白酶體通路的負(fù)調(diào)控,泛素-蛋白酶體通路的精確調(diào)控依賴于三種酶

5、的參與,Cbl-b為其中的泛素連接酶,可以特異性地識(shí)別需要降解的底物蛋白。國(guó)外研究證實(shí)破骨細(xì)胞當(dāng)受到RANKL的刺激后,Cbl-b與RANK及Gab2結(jié)合,誘導(dǎo)其發(fā)生泛素化降解。綜合文獻(xiàn)報(bào)道,我們提出如下假說(shuō):RANKL/RANK通路是導(dǎo)致乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素;Cbl-b通過(guò)誘導(dǎo)RANKL/RANK通路重要分子的泛素化及降解抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移。
　　 本研究以人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231為模型,研究RANKL/RANK通路

6、促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移的機(jī)制,探討Cbl-b在此過(guò)程中的作用,并進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)乳腺癌患者術(shù)后癌組織Cbl-b與RANK的表達(dá),分析其與骨轉(zhuǎn)移發(fā)生、預(yù)后的關(guān)系來(lái)驗(yàn)證Cbl-b對(duì)RANKL/RANK通路的調(diào)控作用。
　　 材料和方法：
　　 1、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面受體蛋白的表達(dá)。
　　 2、Transwell趨化小室法測(cè)定細(xì)胞遷移能力。
　　 3、Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)。
　　 4、免疫

7、共沉降檢測(cè)蛋白間的共結(jié)合。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以Mean±S.D.表示,采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6、Spearman等級(jí)相關(guān)法檢驗(yàn)不同觀察指標(biāo)間的相關(guān)性。采用log-rank檢驗(yàn)及Kaplan-meier曲線比較、描述PFS及OS。
　　 結(jié)果：
　　 一、RANKL促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231遷移
　　 (一)Tran

8、swell趨化小室法顯示RANKL(2μg/ml)誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞遷移增加,遷移指數(shù)為1.7。RANKL誘導(dǎo)的MDA-MB-231細(xì)胞遷移可被RANKL的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑OPG(10μg/ml)阻斷。
　　 (二)RANKL(2μg/ml)刺激MDA-MB-231細(xì)胞30分鐘后p-ERK表達(dá)升高,MEK/ERK通路抑制劑PD98059(25μM)明顯抑制RANKL誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移。
　　 (三)RANKL(2μg/

9、ml)刺激MDA-MB-231細(xì)胞30分鐘后,p-AKT表達(dá)升高,PI3K/AKT通路抑制劑LY294002(50μM)明顯抑制RANKL誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移。
　　 (四)RANKL(2μg/ml)刺激MDA-MB-231細(xì)胞5分鐘后p-Src水平升高,Src家族激酶抑制劑PP2(10μM)顯著抑制RANKL誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移。
　　 (五)RANKL(2μg/ml)刺激MDA-MB-231細(xì)胞5分鐘后p-FAK及p-Gab2水

10、平升高。
　　 (六)RANKL(2μg/ml)及Src抑制劑PP2(10μM)同時(shí)處理MDA-MB-231細(xì)胞30分鐘后,p-FAK及p-AKT水平被抑制而p-ERK的活化不受影響。
　　 二、泛素連接酶cbl-b調(diào)控RANKL誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移
　　 (一)RANKL(2μg/ml)誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移過(guò)程中,Western blot檢測(cè)cbl-b的表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　 (二)泛素蛋白酶體抑制劑硼替佐米

11、(PS341)(10nM)預(yù)處理4小時(shí)抑制Cbl-b的功能后,RANKL誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移增加(遷移指數(shù):PS341+RANKLv RANKL:2.6±0.3 v1.6±0.5,p＜0.05)。
　　 (三)免疫共沉降檢測(cè)Cbl-b與RANKL/RANK通路上游信號(hào)蛋白FAK、Gab2及C-Src存在共結(jié)合。
　　 三、RANK及cbl-b在乳腺癌表達(dá)及與臨床病理特征之間關(guān)系的研究
　　 (一)RANK和Cbl

12、-b表達(dá)的陽(yáng)性率分別為53.1％和55.5％,RANK與Cbl-b之間的表達(dá)成正相關(guān)(r=0.324,P＜0.001);Cbl-b表達(dá)強(qiáng)弱與組織學(xué)分級(jí)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.275,p=0.009)。分層分析顯示RANK陽(yáng)性組患者中,Cbl-b的表達(dá)強(qiáng)弱與遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(r=-0.157,p=0.04),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(術(shù)中加遠(yuǎn)期)成負(fù)相關(guān)(cc=-0.186,p=0.021),與骨轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)。
　　 (二)總?cè)巳褐?RANK表

13、達(dá)陽(yáng)性和陰性的患者的PFS(p=0.817)及OS(p=0.099)無(wú)差異,但分層分析結(jié)果顯示:在發(fā)生遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)移的患者中(67例)RANK表達(dá)的患者的總生存及無(wú)進(jìn)展生存短于RANK陰性的患者,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(PFS:p=0.031;OS:p=0.017);而在發(fā)生遠(yuǎn)期骨轉(zhuǎn)移的患者中,RANK表達(dá)的患者骨轉(zhuǎn)移發(fā)生更早,生存更短。中位無(wú)骨轉(zhuǎn)生存:RANK陰性組v陽(yáng)性組=67±3 v32±7month(p=0.009);中位生存:RANK

14、陰性組v陽(yáng)性組=67±3v32±7month(p=0.017)。
　　 (三)總?cè)巳褐?Cbl-b表達(dá)陽(yáng)性和陰性的患者的PFS(p=0.444)及OS(p=0.254)無(wú)差異,但分層分析結(jié)果顯示:RANK陽(yáng)性患者中,表達(dá)Cbl-b的患者PFS(p=0.046)及OS(p=0.051)較長(zhǎng),而RANK陰性的患者中Cbl-b表達(dá)與否不影響患者的PFS(p=0.46)和OS(p=0.649)。
　　 結(jié)論：
　　 1、

15、RANKL誘導(dǎo)表達(dá)RANK的MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。
　　 2、MEK/ERK及PI3K/AKT信號(hào)通路參與RANKL誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移。
　　 3、C-src、FAK及Gab2參與RANKL誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移。
　　 4、RANKL誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移過(guò)程中,Src激酶抑制劑PP2抑制PI3K/AKT而非MEK/ERK的活化。
　　 5、Cbl-b在RANKL誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移過(guò)程中