金標(biāo)免疫滲濾法檢測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎自身抗體的研究.pdf

1、膠體金標(biāo)記技術(shù)的建立催生了兩種經(jīng)典的免疫學(xué)檢測(cè)方法，斑點(diǎn)金免疫滲濾(DIGFA)和膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)，其中DIGFA由于具有快速、結(jié)果可直接判讀、可單人份檢測(cè)、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為開發(fā)各類快速診斷試劑的技術(shù)基礎(chǔ)，一系列針對(duì)臨床、食品等多個(gè)領(lǐng)域的DIGFA被建立和應(yīng)用。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種自身免疫性疾病，晚期關(guān)節(jié)多發(fā)生畸形難以治愈，早期診斷對(duì)疾病的控制尤為重要，大量研究已經(jīng)表明在臨床癥狀出現(xiàn)好幾年前患者血清中就會(huì)出現(xiàn)

2、特異的自身抗體，對(duì)這些自身抗體的檢測(cè)對(duì)RA的早期診斷非常有利。
　　本文擬建立檢測(cè)RA兩種自身抗體的DIGFA，旨在簡(jiǎn)化檢測(cè)操作、降低檢測(cè)成本、在樣本量少的情況下可快速開展檢測(cè)。為此，首先通過與歐蒙試劑盒對(duì)比及檢測(cè)臨床確定的血清對(duì)待檢抗體特異的抗原進(jìn)行了篩選制備，采用鏈酶親和素-生物素結(jié)合方式將環(huán)瓜氨酸肽(CCP)與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，優(yōu)化了新的含18個(gè)氨基酸的環(huán)肽序列;確定了較穩(wěn)定的類風(fēng)濕因子(RF)特異抗原的原料來(lái)源，同時(shí)優(yōu)化了

3、特異性高的HRP標(biāo)記F(ab')2片段作為酶標(biāo)二抗，并比較了兔IgG、人IgG、Fc片段幾種常用于RF檢測(cè)的抗原性能。
　　接著，本文制備了抗自身抗體的膠體金探針，對(duì)各反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，確定了較好的偶聯(lián)pH在8.2～8.5之間(7μL K2CO3(5％)/mLAu)，最小偶聯(lián)蛋白量為22μg/mLAu，最適大分子穩(wěn)定劑是BSA（免疫級(jí)）和PEG-20K，較優(yōu)洗滌純化緩沖液是Tris-HCl(pH8.2)，最后優(yōu)化了探針凍干的最佳