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文檔簡介
1、目前,肺癌發(fā)病率及死亡率逐年遞增,成為嚴重威脅人們健康的惡性腫瘤之一。其中,肺腺癌發(fā)病率迅速增加,已取代鱗癌成為最常見的病理類型。雖然化療仍然是治療肺癌的重要手段之一,但目前化療效果仍非常有限?,F(xiàn)在普遍認為,肺癌干細胞的存在是導(dǎo)致肺癌患者化療耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因。線粒體是調(diào)控細胞凋亡的中心環(huán)節(jié),是一個形態(tài)結(jié)構(gòu)和細胞分布不斷動態(tài)變化的器官,通過精細調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)、外膜的融合和分裂,滿足細胞內(nèi)各區(qū)域的能量需要、維持mtDNA穩(wěn)定、保護細
2、胞器結(jié)構(gòu)完整。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞中的線粒體較其余癌細胞具有更活躍的融合現(xiàn)象,有助于肺癌干細胞抗凋亡,有可能成為臨床中真正意義上的靶點。因此尋求靶向抑制肺癌干細胞線粒體融合,逆轉(zhuǎn)肺腺癌干細胞順鉑耐藥,提高患者生存率,具有重要的臨床意義。然而對于肺癌干細胞線粒體融合現(xiàn)象的研究尚處于空缺階段,因此,本研究旨在觀察肺癌干細胞線粒體融合現(xiàn)象且利用肽核酸靶向抑制肺癌干細胞線粒體融合,比較其抑制后的順鉑耐藥情況,以期為肺癌干細胞的靶向治療提供實驗基礎(chǔ)
3、。
目的:
1.觀察肺癌干細胞線粒體融合相關(guān)蛋白的表達。
2.觀察肺癌干細胞線粒體能量代謝的生物學(xué)特性。
3.探討肽核酸靶向抑制肺癌干細胞線粒體融合的影響。
方法:采用腫瘤干細胞無血清培養(yǎng)基(serum-free medium,SFM)的方法將A549細胞誘導(dǎo)成具有干性的A549細胞球體,采用RT-PCR和Western-blot技術(shù)分別檢測A549細胞及A549細胞球線粒體促融合蛋白M
4、itofusin1、Mitofusin2、Opa1和Atad3a的mRNA和蛋白的表達;采用流式細胞儀檢測A549細胞及A549細胞球線粒體膜電位;采用激光共聚焦觀察A549細胞及A549細胞球線粒體空間分布;固相肽合成法合成肽核酸-三苯磷復(fù)合物;激光共聚焦觀察肽核酸-三苯磷復(fù)合物對肺癌干細胞的轉(zhuǎn)染和鑒定;采用RT-PCR和Western-blot技術(shù)分別檢測肽核酸-三苯磷復(fù)合物轉(zhuǎn)染肺癌干細胞后干擾 mtDNA基因表達情況;Wester
5、n-blot技術(shù)檢測線粒體融合相關(guān)蛋白的表達情況,同時檢測肽核酸-三苯磷復(fù)合物轉(zhuǎn)染A549細胞球及A549細胞后ATP含量的變化;流式細胞儀檢測各組細胞凋亡,線粒體膜電位指標(biāo)。
結(jié)果:A549細胞球中線粒體促融合蛋白Mfn1、Mfn22、Opa1和Atad3a分子的mRNA和蛋白的表達均較A549細胞明顯升高;A549細胞球中線粒體繞核分布且線粒體膜電位較A549普通細胞高;肽核酸-三苯磷復(fù)合物作用于A549細胞球及A549細
6、胞線粒體融合后,線粒體融合相關(guān)蛋白Mfn1、Mfn2和Opa1蛋白的表達均下降,而Atad3a的表達則無明顯變化,同時伴有2組細胞ATP含量的明顯下降;A549細胞球凋亡率較 A549細胞明顯升高,而線粒體膜電位則明顯下降。
結(jié)論:1. A549肺癌細胞球的線粒體融合相關(guān)蛋白Mfn1、Mfn2、Opa1、Atad3a的蛋白和mRNA表達較A549細胞明顯升高。
2.肽核酸-三苯磷復(fù)合物積聚于高ψm的A549肺癌細胞球
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