新型防治流感藥物發(fā)現(xiàn)研究.pdf

1、流感是一種全球性的傳染性疾病。季節(jié)性流感中成人的發(fā)病率約為5％，兒童的發(fā)病率約20%。全球每年流感重癥患者達(dá)300～500萬人，死亡達(dá)25～50萬人。盡管已有的抗流感藥物具有良好的治療作用，但是耐藥性的產(chǎn)生以及新病毒亞型的出現(xiàn)時刻對其療效發(fā)出挑戰(zhàn)。因此，新型防治流感藥物的發(fā)現(xiàn)一直是醫(yī)藥科學(xué)研究者們努力的方向。
　　 本論文在深入認(rèn)識流感病毒結(jié)構(gòu)、功能以及致病特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，在病毒和宿主相互作用的多個環(huán)節(jié)中尋找潛在的藥物作用靶點(diǎn)，建

2、立相應(yīng)的篩選模型，以期發(fā)現(xiàn)具有抗流感作用的先導(dǎo)化合物。本論文研究內(nèi)容主要包括以下幾方面：
　　 一、RNA聚合酶高通量篩選模型的建立
　　 流感病毒RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)是由PA、PB1和PB2構(gòu)成的異源三聚體。除了RNA依賴的RNA聚合酶的活性，RdRp還具有核酸內(nèi)切酶、蛋白酶以及核酸外切酶等活性。RdRp是病毒基因組復(fù)制轉(zhuǎn)錄過程中的關(guān)鍵酶，其抑制劑的發(fā)現(xiàn)對于病毒復(fù)制機(jī)制研究以及抗病毒新藥的發(fā)現(xiàn)都具有重要

3、意義。目前已有RdRp抑制劑進(jìn)入臨床Ⅲ期研究。
　　 本章從流感病毒中直接提取RdRp，建立了其活性測定方法。RdRp已有的活性測定方法依賴于放射性同位素標(biāo)記的核苷酸，不僅成本高、需要特定的防護(hù)措施，而且操作繁瑣、無法準(zhǔn)確定量。我們利用RNA聚合反應(yīng)中消耗ATP的特點(diǎn)，通過測定體系中剩余的ATP含量反應(yīng)RdRp活性。本方法使用的商品化ATP檢測試劑直接加入微孔板便可用酶標(biāo)儀測定反應(yīng)程度，具有操作簡單、安全、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)，適用

4、于大量樣品的活性評價。應(yīng)用該方法，我們建立了RNA聚合酶抑制劑高通量篩選模型，并對樣品庫中部分樣品進(jìn)行了篩選，但并未發(fā)現(xiàn)活性化合物。
　　 二、流感病毒內(nèi)切酶抑制劑篩選模型的建立
　　 內(nèi)切酶是構(gòu)成RdRp的PA蛋白的N端片段，在宿主細(xì)胞內(nèi)切割含有Cap-1結(jié)構(gòu)的pre-mRNA作為引物啟動病毒基因轉(zhuǎn)錄。內(nèi)切酶催化的這一反應(yīng)不僅是病毒復(fù)制的必需步驟，而且是病毒抑制宿主基因表達(dá)的機(jī)制之一。由于哺乳動物體內(nèi)并不存在類似的生化

5、反應(yīng)，流感病毒內(nèi)切酶特異性抑制劑很可能成為高效低毒的抗流感藥物。內(nèi)切酶的活性中心在2009年剛剛確定，還沒有抑制劑進(jìn)入臨床前研究。建立內(nèi)切酶抑制劑篩選模型不僅有利于對內(nèi)切酶功能特點(diǎn)進(jìn)行深入研究，同時對發(fā)現(xiàn)具有全新作用機(jī)制的防治流感的藥物具有重要意義。
　　 本章建立了流感病毒內(nèi)切酶的原核表達(dá)體系，獲得了具有活性的純化內(nèi)切酶蛋白。同RNA聚合酶一樣，已有的內(nèi)切酶檢測方法依賴于放射性同位素標(biāo)記的底物，需要對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳以進(jìn)行定性

6、定量分析。我們以M13噬菌體基因組環(huán)狀ssDNA為底物，設(shè)計了基于外切酶-染料的內(nèi)切酶活性測定方法。該方法首先進(jìn)行內(nèi)切酶反應(yīng)，使底物環(huán)狀ssDNA降解成線性ssDNA片段；隨后線性ssDNA在核酸外切酶作用下降解生成dNDP，鏈長度縮短。利用ssDNA特異性熒光染料對體系剩余ssDNA進(jìn)行定量，即可反應(yīng)內(nèi)切酶活性。本方法避免了放射性同位素的使用，操作簡便，靈敏準(zhǔn)確，能夠?qū)崿F(xiàn)自動化操作進(jìn)行高通量篩選。另外，本章還利用內(nèi)切酶的晶體結(jié)構(gòu)，利用

7、分子對接對樣品庫中化合物進(jìn)行虛擬篩選，并對具有潛在內(nèi)切酶抑制活性的化合物進(jìn)行了活性評價。
　　 三、神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選模型的再評價
　　 神經(jīng)氨酸酶(NA)抑制劑是臨床常用抗流感的藥物，本實(shí)驗(yàn)室己于2002年建立了NA抑制劑高通量篩選模型并對大量化合物進(jìn)行了活性評價。長期應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)，該模型易受多種因素干擾，不同批次的檢測結(jié)果往往難以整合。因此，本章對已有模型進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以測定酶活性為基礎(chǔ)，以評價抑制劑作用為研究

8、目標(biāo)，建立活性測定的標(biāo)準(zhǔn)方法。同時，對該方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性予以評價，確定測定結(jié)果的可靠、準(zhǔn)確、穩(wěn)定。
　　 不確定度利用測量值分散性表示測定的準(zhǔn)確程度，比誤差理論更具有科學(xué)性。對于高通量篩選模型，不確定度評價可以從驗(yàn)證方法有效性、數(shù)據(jù)等效性和明確差異顯著性等方面對模型的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性予以說明。采用不確定度作為篩選模型質(zhì)量的衡量指標(biāo)，是提高活性化合物發(fā)現(xiàn)效率的途徑之一。
　　 四、3-脫氧蘇木查爾酮抗流感作用及其機(jī)制研究

9、
　　 3－脫氧蘇木查爾酮是利用流感病毒NA抑制活性示蹤蘇木化學(xué)成分分離獲得的活性化合物。本章在細(xì)胞水平上確認(rèn)了其體外抗流感活性，明確其作用特點(diǎn)，并且對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3-DSC不影響病毒引起的紅細(xì)胞凝集，僅在較高濃度(30μM)時對宿主細(xì)胞內(nèi)病毒基因復(fù)制以及蛋白表達(dá)具有抑制作用。
　　 隨后，我們又從宿主因素入手考察了3-DSC其對病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞因子分泌的影響。結(jié)果表明3-DSC在1.2μ

10、M、6μM和30μM濃度下能夠劑量依賴性減少病毒感染后宿主細(xì)胞的凋亡，并抑制caspase3/7、caspase8和caspse9的激活；劑量依賴性減少感染后內(nèi)皮細(xì)胞分泌趨化因子CCL5和CXCL10，減少巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-6和IL-1β。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測3-DSC體外抗流感機(jī)制包括抑制病毒復(fù)制、抗凋亡和抗炎三方面。
　　 綜上所述，本研究根據(jù)對流感病毒復(fù)制過程以及致病因素理性認(rèn)識，以藥物作用靶點(diǎn)為中心，以抗流